pH敏感型荧光纳米胶束用于烟用纸张中大肠杆菌的快速检测

范子彦，师默闻，刘珊珊，李中皓，李 倩，邓惠敏，杨 飞，王 颖，边照阳，唐纲岭*

1.国家烟草质量监督检验中心，郑州高新技术产业开发区枫杨街2号 450001

2.河南中烟工业有限责任公司技术中心，郑州市经开区第三大街8号 450000

致病微生物引发的食源性安全风险引起了社会各界的广泛关注，对食品、药品、卷烟等产品包装中微生物的检测成为研究热点［1］。平板计数法［2］、聚合酶链式反应法（PCR法）［3］、荧光光电法［4］和流式细胞术［5］等方法逐步发展起来。平板计数法技术准确、可靠，但需要增菌培养，检测周期长；PCR法灵敏度高，检测速度快，但是对人员要求高；流式细胞术仪器昂贵，检测灵敏度较低［2-5］。传统培养理论认为，微生物生长过程中会大量分泌CO2气体，从而导致培养基中pH发生变化，荧光光电法将这种pH变化转化为可读取的荧光信号，替代传统的肉眼或者显微镜观察，大大提高了微生物的检测灵敏度［6-8］。

典型的荧光光电微生物传感器使用玻璃纤维将pH敏感型荧光染料包裹，通过检测荧光信号的变化实现对微生物的检测［4,9］。传感器需要对玻璃纤维进行化学修饰来保证透光性和荧光染料不泄露，造成传感器构建成本高昂和不稳定。为了克服这一缺点，将pH敏感型荧光染料共价固定在纳米胶束表面，与热琼脂溶液混合后制备荧光传感凝胶，传感凝胶通过响应大肠杆菌生长过程中pH的变化实现对大肠杆菌的快速检测［10-12］。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

0.22 μm水相滤膜、Slide-A-LyzerTM微量透析管（美国Thermo Fisher Scientific公司）；灭菌袋（南京便诊公司）；大肠杆菌（山东大学基础医学院提供）；烟用纸张（国家烟草质量监督检验中心提供）。

氨基修饰的磷脂聚乙二醇（DSPE-PEG2000-NH2，98%，西安瑞禧生物科技有限公司）；异硫氰酸荧光素（Fluorescein isothiocyanate,FITC）、二甲亚砜、琼脂、胰蛋白胨、氯化钠、乳糖、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、月桂基硫酸钠、氢氧化钠（AR，美国Sigma公司）；生理盐水（南京便诊公司）。

CP2245电子分析天平（感量0.000 1 g，德国Satorious公司）；Mastersizer 3000动态光散射粒度分析仪（英国Malvern公司）；FluoroMax-4稳态分子荧光仪（日本Horiba公司）；Biolumix-32微生物实时荧光光电系统（美国Biolumix公司）；E-Gel Imager凝胶成像系统，超净工作台（美国Thermo公司）；JY92-IIN细胞破碎仪（宁波新芝公司）；ZWY-2102C空气浴摇床（上海智城公司）；Milli-Q超纯水纯化系统（美国Millipore公司）；微生物传感器容器（美国Biolumix公司）；Merlin扫描电子显微镜（德国Zeiss公司）。

1.2 方法

1.2.1 pH敏感型荧光纳米传感器构建

使用异硫氰酸荧光素标记氨基修饰的磷脂聚乙二醇制备具有两亲性的DSPE-PEG-FITC聚合物分子，DSPE-PEG-FITC滴入水相溶液中自组装成纳米胶束，与热琼脂溶液混合，冷却后制备pH敏感型纳米传感凝胶，装入测试管中构建pH敏感型荧光纳米传感器，如图1所示。

图1 pH敏感型荧光纳米传感器构建示意图Fig.1 Schematic diagram of fluorescent pH-sensitive nano-micelle biosensors

1.2.2 pH敏感型荧光纳米胶束的制备与表征

取20 mg DSPE-PEG2000-NH2溶于1 mL DMSO中；完全溶解后，加入4 mg FITC，避光条件下加热至90℃，搅拌反应2 h；冷却至室温，利用微量透析管在纯水中透析2 d，冷冻干燥制备DSPEPEG-FITC［13］。

将DSPE-PEG-FITC复溶至1 mL DMSO中，制备成10 mg/mL的纳米胶束溶液。取10 μL该溶液，逐滴加至2 mL浓度为20 mmol/L、pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液（Phosphate buffer saline，PBS）中，至胶束浓度为50 mg/L。使用30%功率的超声波在两种条件下（分别为连续超声1 min和开5 s、关5 s的间歇超声1 min）对纳米胶束溶液进行超声分散，使用0.22 μm水相滤膜过滤胶束溶液后，使用动态光散射法对纳米胶束的粒径进行表征。

配制pH 4.5～9.0的磷酸缓冲溶液，添加荧光纳米胶束至终浓度为50 mg/L，使用分子荧光仪观察不同pH条件下荧光纳米胶束的荧光强度，激发波长480 nm，发射波长520 nm。

1.2.3 pH敏感型荧光纳米胶束传感器的构建

参照GB 4789.3—2016［2］的方法配制月桂基硫酸盐胰蛋白胨（Lauryl tryptose broth,LST）肉汤，并进行一定修改。在950 mL去离子水中加入20 g胰蛋白胨，5 g氯化钠，5 g乳糖，2.75 g磷酸氢二钾，2.75 g磷酸二氢钾，0.1 g月桂基硫酸钠，混匀至完全溶解；用5 mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.4；用去离子水定容至1 L；在1.05 kg/cm2（15 psi）高压下蒸汽灭菌20 min。

取400 mg琼脂溶于纯水中，煮至沸腾，即制得2%的热琼脂溶液。琼脂溶液冷却至70℃后，加入荧光纳米胶束颗粒至终浓度50 mg/L，震荡混匀后置入微生物传感器容器底部，使用0.22 μm水相滤膜将传感凝胶和液体培养基分离。纳米胶束凝胶冷却后，使用凝胶成像系统观察琼脂对荧光信号响应的影响。

1.2.4 烟用纸张样品中大肠杆菌的快速检测

在无菌环境下，称取25 g烟用纸张，裁剪成1～2 cm2的纸张碎片，装入含有0.85%无菌生理盐水的225 mL灭菌袋中，用拍击式均质器拍打2～4 min，混合均匀，取1 mL加入到荧光传感器测试管中，使用实时快速微生物光电系统测试样品，实时快速微生物系统参数如表1所示。将剩余样品混合均匀，密封后36℃下过夜培养，用于增菌检测。

表1 实时快速微生物检测系统参数Tab.1 Parameters of real-time quick microorganism detection system

2 结果与讨论

2.1 荧光纳米胶束的制备表征

2.1.1 纳米胶束的荧光标记

使用异硫氰酸荧光素（FITC）对纳米胶束单体（氨基修饰的磷脂聚乙二醇，DSPE-PEG2000-NH2）上的氨基进行共价偶联。FITC最大吸收波长为480～495 nm，最大发射波长为520～530 nm，可呈现出明亮黄绿色荧光，其含有的异硫氰基在碱性（pH 9.0～9.5）条件下，可以与纳米胶束单体上亲水端的氨基结合而实现荧光标记。标记有荧光素的纳米胶束单体在水相溶液中可以自组装成纳米胶束，其中磷脂提供疏水核心，PEG-FITC提供亲水端，暴露在水相中的荧光素具有随pH升高荧光强度增加的特点，从而实现溶液中pH变化的监控［14-15］。将制备好的标记有FITC的纳米胶束单体溶于pH为8.0的20 mmol/L磷酸的磷酸缓冲溶液中，纳米胶束的分散浓度为50 mg/L，使用480 nm激发，520 nm发射检测纳米胶束溶液，结果如图2所示。实线是标记FITC的纳米胶束，虚线是未标记的纳米胶束，标记FITC后荧光信号大幅提升，表明标记成功。

图2 纳米胶束荧光标记表征结果Fig.2 Fluorescence characterization of FITC labeled DSPE-PEG2000 nano-micelles

2.1.2 纳米胶束的粒径表征

传感器设计使用0.22 μm的水相滤膜对传感凝胶和培养基进行分离，小于220 nm的颗粒会向培养基中扩散，而颗粒粒径过大会导致在传感凝胶中分散不均匀，因此需要对纳米胶束的粒径进行控制。纳米胶束单体通过自组装在水相体系中形成纳米胶束颗粒，粒径的大小受到纳米胶束单体添加浓度和超声分散时间的影响。因此，使用动态光散射粒度分析仪（粒度仪）考察了25和50 mg/L两个纳米胶束单体浓度条件下，两种不同超声条件下纳米胶束粒径的分布，结果如图3所示。纳米胶束的粒径随纳米胶束单体浓度的增加而变大，温和的间歇超声条件下纳米胶束粒径大于连续超声模式。为了避免连续超声对纳米胶束稳定性的影响，选择50 mg/L的纳米胶束单体浓度和间歇超声作为后续的实验条件，在该条件下纳米胶束的粒径范围是295～458 nm。

图3 不同纳米胶束单体添加浓度和超声条件下纳米胶束颗粒的分布（动态光散射表征）Fig.3 DLS characterization of pH-sensitive nano-micelles under different concentrations and ultrasonic conditions

为了进一步表征实验条件下纳米胶束的粒径分布，使用扫描电子显微镜对纳米胶束粒径进行表征，结果如图4所示。结果表明纳米胶束的粒径在300～500 nm之间。这一结果与动态光散射的表征结果一致。

图4 纳米胶束的原子力显微镜表征Fig.4 Atomic force microscope characterization of pH-sensitive nano-micelles

2.2 荧光纳米胶束的pH响应

纳米胶束单体上亲水端共价偶联了FITC，在纳米胶束的自组装过程中，磷脂形成疏水核心，PEG-FITC具有亲水性而暴露在纳米胶束外部。荧光染料FITC对pH敏感，图5a为不同pH条件下荧光纳米胶束的荧光强度。可知，当pH从4.5升高到9.0时，纳米胶束的荧光信号快速增强，表明所制备的纳米胶束可以响应分散体系中pH的变化。为了进一步考察纳米胶束在琼脂糖凝胶中的荧光性能，添加纳米胶束单体到70℃琼脂糖凝胶溶液中制备纳米胶束凝胶，并浸泡在不同pH的缓冲溶液中，如图5b所示。结果表明，纳米胶束在凝胶状态下也可以响应体系pH的变化。实验中还发现，离心管上清液中的荧光信号很低，表明琼脂凝胶对纳米胶束的固定较好，没有发生纳米胶束的泄露。

图5 不同pH缓冲溶液中纳米胶束（a）及其凝胶（b）荧光强度的响应Fig.5 Fluorescence intensity response of pH-sensitive nano-micelle(a)and gel（b）in buffers of different pH

2.3 烟用纸张中大肠杆菌的检测

根据传统培养理论，大肠杆菌在生长代谢过程中，会产酸产气，导致培养基溶液pH下降，这为实时检测大肠杆菌的生长提供了理论依据。按照图1的设计，构建了pH敏感型微生物纳米胶束传感器，选取一组大肠杆菌平板法检测阳性的烟用纸张进行直接检测和增菌培养后检测，结果如图6所示。传感器的荧光信号值随着培养时间的增加而降低，增菌培养后的检出时间为2.6 h，直接检测的检出时间为9.1 h，而阴性纸张在22.0 h的检测窗口未有大肠杆菌检出，表明构建的纳米胶束传感器可用于烟用纸张的直接、快速检测。同时，使用标准菌株对比快速检测方法和平板计数方法的差异，使用平板计数的大肠杆菌的测试结果校准快速检测方法的检出时间，并使用检出时间评估大肠杆菌数量，结果如图7所示。可知，微生物初始数量越多检测时间越短。结果表明，生物传感器可用于烟用纸张中大肠杆菌水平的简单评估。

图6 大肠杆菌生长过程中生物传感器的荧光信号响应Fig.6 Fluorescence intensity response of biosensors during microorganism growing

图7 烟用纸张大肠杆菌数量与检测时间的相关性Fig.7 Correlation between sum of Escherichia coli in cigarette paper and detection time

3 结论

①基于传统培养理论和pH敏感型荧光纳米胶束的制备，成功构建了荧光纳米胶束传感器；②以磷脂为疏水核心，PEG-FITC为亲水端，通过自组装方式制备了荧光纳米胶束，使用动态光散射和原子力显微镜表征的优化条件下制备的纳米胶束粒径在300～500 nm之间；③荧光光谱的数据表明，荧光纳米胶束及其凝胶激发和发射波长分别在480和520 nm；在pH 4.5～9.0之间，随着pH的升高，荧光信号增加，可以快速响应微生物生长过程中pH的变化；④实际样品分析表明，pH敏感型荧光纳米胶束传感器可以用于烟用纸张中大肠杆菌的直接检测，检测时间相比传统平板计数法大幅缩短，并可用来快速评估烟用纸张样品中大肠杆菌的数量。