烟草野火病菌噬菌体的分离及盆栽防治试验

孙宏伟，李 慧，刘瑞清，张 民，荆瑞勇，刘俊杰，孙剑萍*

1.中国烟草总公司黑龙江省公司牡丹江烟草科学研究所，哈尔滨市道里区哈药路17号 150076

2.牡丹江烟叶公司，黑龙江省牡丹江市西地明街63号 157011

3.黑龙江八一农垦大学，黑龙江省大庆市高新区新风路5号 163319

4.中国科学院东北地理与农业生态研究所，哈尔滨市南岗区哈平路138号 150081

烟草野火病是由烟草假单胞杆菌属的丁香假单胞烟草致病变种（Pseudomonas syringae pv.tabaci）引起的叶部病害，在世界主要烟草产区均有发生。目前，该病已成为黑龙江省、吉林省烟草产区的主要病害［1］。烟草野火病的防治主要以化学防治为主，但由于农药的大量使用，不仅使病原菌的抗药性增强，还使烟叶中的农药残留量增加，严重影响烟叶和生态的可持续发展。因此，烟草野火病的生物防治尤为重要。目前，我国对烟草野火病生物防治的研究主要集中在拮抗生防菌的筛选、田间防效试验、防治机理等方面。孙宏伟等［2］从健康烟叶上分离到287个细菌，筛选出14个对野火病菌有抑制作用的菌株，其中抑菌效果最好的是枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。刘宇帅等［3］通过室内平板拮抗作用实验筛选到1株对烟草野火病菌具有拮抗作用的生防菌株CZS。万秀清等［4］通过田间防效试验发现荧光假单胞杆菌PF7-5活菌对野火病的抑菌效果达到91%。虽然拮抗菌类的生物防治试剂已经商品化，但大量使用会导致微生物群落失衡等问题。噬菌体特异性强，只感染目标菌群，不破坏土壤微生物的平衡，不对环境造成污染［5］。目前，用噬菌体防治烟草细菌性病害的研究较少，且多集中在青枯病的防治方面。为此，分离纯化了对烟草野火病菌有裂解效果的噬菌体，并考察其对野火病的防治效果，旨在为用噬菌体防治烟草野火病提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试烟草品种为感病品种龙江911。2016年6月，在黑龙江省穆棱县和肇东县烟田采集感染烟草野火病的烟叶和土壤样品。采用5点取样法收集土壤样品，每点取表层土壤500 g，将每块烟田5个取样点的5份样品充分混合后备用。

1.2 方法

1.2.1 野火病菌的分离纯化与鉴定

无菌条件下，取病健交界处的烟叶组织（直径0.5 cm）。用70%乙醇对烟叶组织表面进行消毒（30～60 s），无菌水漂洗3～4次，置于NA固体培养基上，28℃培养至烟叶组织周围长出细菌。用接菌环蘸取细菌菌液在NA固体培养基上划线，培养至出现单菌落后，用牙签挑取典型野火病菌的单菌落置于1.0 mL的NA液体培养基中，摇床过夜振荡培养（28℃，150 r/min）后，加 0.5 mL甘油，-80℃保存。将保存的菌液送往生工生物工程（上海）股份有限公司进行病原菌的种类鉴定，并参照孙剑萍等［6］对黑龙江省烟草野火病菌生理小种的鉴定方法，对分离的烟草野火病菌进行生理小种鉴定。

野火病菌的活化：将保存的野火病菌在NA固体培养基上划线培养，挑取单菌落接种于5 mL NA液体培养基中，28℃、200 r/min振荡培养12 h，备用。

NA液体培养基：蛋白胨5 g，牛肉浸膏3 g，氯化钠1.5 g，去离子水1 L，于121℃高压灭菌20 min。NA固体培养基：NA液体培养基中加入1.8%琼脂粉后高压灭菌。

1.2.2 噬菌体的分离

参照 Nakayama等［7］和苏靖芳等［8］的方法分离噬菌体。将5 g土样置于加有10 mL NA液体培养基的50 mL离心管中混匀，28℃振荡过夜。取出静置24 h后，10 000 r/min离心10 min，上清液过0.22 μm滤膜，4 ℃保存。

将过滤后的1 mL土壤悬浮液与0.2 mL活化的野火病菌菌液混合于5 mL NA液体培养基中振荡培养，当共培养液澄清后静置1 h，10 000 r/min，离心10 min，取上清液经0.22 μm滤膜过滤，即得到噬菌体粗提液。

1.2.3 噬菌体的纯化

用SM缓冲液作为稀释液，对0.1 mL噬菌体粗提液进行1至10倍的稀释。取1 mL不同稀释倍数的噬菌体稀释液与0.2 mL活化的野火病菌菌液混合，静置孵育15 min后，加入6 mL冷却至47℃左右的NA半固体培养基中，混匀后立即倒入已凝固的NA固体培养基平板上制成双层平板，待上层培养基凝固后倒置放入28℃恒温培养箱，培养24～48 h，观察噬菌斑的生成［9-11］。当出现噬菌斑后，选择适当稀释倍数的双层平板挑取肉眼可辨、边缘光滑的单个噬菌斑接入5 mL生长至对数期的野火病菌菌液中，28℃、200 r/min振荡培养12 h后，10 000 r/min离心10 min。上清液过0.22 μm的微孔滤膜，取0.1 mL滤液进行1至10倍稀释，将各稀释倍数的滤液与0.2 mL生长至对数期的野火病菌菌液混匀后制作双层平板。28℃培养24～48 h，当出现噬菌斑后，选择适当稀释倍数的双层平板挑取肉眼可辨、边缘光滑的单个噬菌斑，重复3～5次即得到纯化的野火病菌噬菌体［10］，4℃保存。

SM缓冲液（噬菌体保护液）：取NaCl 5.8 g，MgSO4·7H2O 2.0 g，1 mol/L Tris盐酸（pH 7.5）50 mL，2%明胶5 mL，加去离子水溶解，定容至1 L，于121℃灭菌30 min，4℃保存。

1.2.4 野火病菌悬液的制备

将保存的野火病菌在NA固体培养基上划线培养，挑取单菌落接种于5 mL NA液体培养基中，28℃、200 r/min振荡培养12 h。将培养后的野火病菌菌液按照1∶40的比例加入装有NA液体培养基的三角瓶中，28℃、160 r/min，振荡培养至野火病菌对数生长期，即为野火病菌菌悬液，稀释10倍后用于接种。

1.2.5 噬菌体悬液的制备

挑取保存的噬菌体放入装有1 mL SM悬浮液的离心管中，4℃静置12 h后，12 000 r/min、4℃离心 10 min，取 500 μL 离心后的上清液与 500 μL对数生长期的野火病菌菌液混合于5 mL NA液体培养基中，28℃、160 r/min，振荡培养2～3 d，直至混合液澄清。将澄清的混合液12 000 r/min、4℃离心10 min。上清液经0.22 μm的微孔滤膜过滤后，按1∶40的比例转接至对数生长期的野火病菌菌悬液中，待菌液澄清后即获得含有大量噬菌体的裂解液，按照每500 mL加入1～2滴氯仿的比例加入氯仿杀死未被裂解的细菌细胞，4℃保存。

1.2.6 接种方法及试验设计

将6～8片真叶大小的烟苗移栽到花盆（直径25 cm）中，置于具有遮阴网的大棚中培养至团棵期，进行防效试验。试验处理及编号见表1。针刺接种：用灭菌大头针刺破烟叶，每株针刺2片烟叶，每片烟叶刺10个针孔。用常规农用喷雾器对针刺后的烟株进行喷施，保湿24 h，每个处理5株烟草，4次重复。喷雾接种：用常规农用喷雾器喷施团棵期的烟株，保湿24 h，每个处理10株烟草，4次重复。

1.2.7 病情调查及统计分析

针刺接种、喷雾接种分别处理15、20 d后，出现典型的野火病症状（病斑中心褐色或白色坏死，病斑周围有明显的黄绿色晕圈）开始进行调查。针刺接种调查病斑直径，喷雾接种调查病情指数。以黄绿色晕圈的大小来确定病斑直径或病斑面积，计算防效。参照标准GB/T 23222—2008［12］对病叶进行分级。

表1 盆栽试验的处理及编号Tab.1 Treatments and number of pot experiments

病情指数=［Σ（各级发病叶片数×该病级值）/（调查总叶数×9）］×100

防效=［（对照病情指数-处理病情指数）/对照病情指数］×100%

图1 野火病菌噬菌体T-109和T-ZD的噬菌斑Fig.1 Plaques of bacteriophages T-109 and T-ZD from P.syringae pv.tabaci

2 结果与分析

2.1 野火病菌及其噬菌体的分离与鉴定

经生工生物工程（上海）股份有限公司鉴定后，得到两株烟草野火病菌菌株。将从穆棱县、肇东县烟叶上分离的野火病菌分别命名为109和ZD。经生理小种鉴定，109和ZD分别属于Ⅱ型和Ⅲ型生理小种。将从宿主野火病菌109和ZD中分离的噬菌体分别命名为T-109和T-ZD。经4次纯化后，噬菌体T-109和T-ZD在双层平板上均形成圆形、清晰透明、边缘光滑的噬菌斑（图1）。

2.2 盆栽针刺接种的防治效果

由表2和图2可知，A1处理的防效最好，为98.64%；防效最差的是B2处理，为29.41%。只喷施噬菌体原液（C1处理）不会引起野火病的发生。先喷施噬菌体后接种的处理（A1和B1）对野火病菌109的防效好于先接种后喷施噬菌体的处理（A2和B2），且差异显著。A1处理对野火病菌109的防效好于B1处理，但两者之间无显著差异。A2和B2处理之间具有差异显著性，说明在野火病菌侵染烟叶之前，需要足够多的噬菌体来充分裂解野火病菌。

表2 噬菌体对野火病菌109的针刺接种防治效果①Tab.2 Control effects of bacteriophages on P.syringae pv.tabaci 109 by needle puncturing inoculation

图2 噬菌体对野火病菌109针刺接种试验中的烟叶表型Fig.2 Phenotypes of tobacco leaves in control experiments of bacteriophages against P.syringae pv.tabaci 109 by needle puncturing inoculation

由表3和图3可知，D1处理的防效最好，为96.68%；防效最差的是E2处理，为5.42%。只施用噬菌体原液（F1处理）不会引起野火病的发生。先喷施噬菌体后接种处理（D1和E1）对野火病菌ZD的防效好于先接种后喷施噬菌体处理（D2和E2），且差异显著。D1处理对野火病菌ZD的防效好于E1处理，但二者之间无显著差异。

针刺接种防效试验中，先喷施噬菌体后接种处理的防效高于先接种后喷施噬菌体处理，且达到显著差异。可能由于接种2 h后，野火病菌已经形成侵染，即使再喷施噬菌体也很难裂解侵染后的野火病菌。由表2和表3可知，A2和D2处理、B2和E2处理的防效差异较大，可能与野火病菌109和ZD侵染烟草品种龙江911的潜伏期不同有关。

表3 噬菌体对野火病菌ZD的针刺接种防治效果Tab.3 Control effects of bacteriophages on P.syringae pv.tabaci ZD by needle puncturing inoculation

图3 噬菌体对野火病菌ZD针刺接种试验中的烟叶表型Fig.3 Phenotypes of tobacco leaves in control experiments of bacteriophages against P.syringae pv.tabaci ZD by needle puncturing inoculation

2.3 盆栽喷雾接种的防治效果

由表4可知，b2处理的防效最好，为28.23%；防效最差的是b1处理，为-2.69%。只喷施噬菌体原液（c1处理）可引起野火病的发生，但病情较轻微。先喷施噬菌体后接种的处理（a1和b1）和先接种后喷施噬菌体的处理（a2和b2）对野火病菌109的防效没有显著性差异。

由表5可知，e1处理的防效最好，为56.05%；防效最差的是e2处理，为23.79%。只施用噬菌体原液（f1处理）可引起野火病的发生，但病情较轻微。先喷施噬菌体后接种的处理（d1和e1）和先接种后喷施噬菌体的处理（d2和e2）对野火病菌ZD的防效无显著差异。噬菌体对野火病菌109和ZD的盆栽喷雾接种防效与针刺接种防效有较大差别，可能与环境因素对噬菌体的存活影响较大有关。

表4 噬菌体对野火病菌109的喷雾接种防治效果Tab.4 Control effects of bacteriophages on P.syringae pv.tabaci 109 by spraying inoculation

表5 噬菌体对野火病菌ZD的喷雾接种防治效果Tab.5 Control effects of bacteriophages on P.syringae pv.tabaci ZD by spraying inoculation

3 结论

①以烟草野火病菌109和ZD为宿主，分离到噬菌体T-109和T-ZD。②针刺接种试验中，先喷施噬菌体后接种处理的防效优于先接种后喷施噬菌体处理，且差异显著。噬菌体裂解原液的防效优于10-1倍噬菌体裂解原液的防效。③喷雾接种试验中，无论是先喷施噬菌体后接种处理还是先接种后喷施噬菌体处理，其防效均无显著性差异。噬菌体裂解原液的防效和10-1倍噬菌体裂解原液的防效无显著差异。