急性肝衰竭模型猪微环境对脂肪间充质干细胞生物学特性的影响

郭瑞红 潘小平 侯晓丽张 悦 江夏薇 汪恬甜刘寿荣

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）移植治疗终末期肝病获得较多的关注，其来源众多，主要包括骨髓、脂肪组织、羊膜、胎盘、脐带血等[1-5]。动物实验和临床研究显示，MSC移植治疗终末期肝病，可明显提高患者的生存率，改善患者肝功能。与骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）相比[6]，脂肪间充质干细胞（adipose derived mesenchymal stem cells，ADMSCs）分化为肝细胞的潜能更大，并且从慢性乙肝患者身上分离出的ADMSCs在培养时不易感染乙型肝炎病毒，因此，ADMSCs更适合作为慢性乙型肝炎患者的细胞替代治疗。Mohsin等人[7]在体外模型中用损伤的肝组织预处理MSC，结果显示提高了MSC中肝细胞特异性基因的表达。从肝损伤大鼠中分离的血清提高了BMSCs的肝向分化功能，并且证明比肝细胞生长因子更为有效，这表明某些病理环境可能影响MSC的特征[8]。然而，尚不清楚肝衰竭患者的ADMSCs是否因肝功能障碍而改变，以及从终末期肝病患者中分离的ADMSCs是否是自体移植的潜在候选者。小型模型猪在解剖、生理和生物化学等方面与人类相似，可作为人类医学研究的最理想的模型动物[9]，因此，本研究获取猪ADMSCs进行比较。通过对比急性肝衰竭猪脂肪来源的间充质干细胞（adipose derived mesenchymalstem cellsfrom acute liverfailure porcine，ALF-ADMSCs）和正常猪来源的 ADMSCs（adipose derived mesenchymal stem cells from normal porcine，Nor-ADMSCs）的细胞形态，细胞表型，增殖能力，分化潜能等来鉴定急性肝衰竭对猪ADMSCs生物学特性的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选用雄性微型巴马猪2只，体质量10～12kg，购自上海甲干生物科技有限公司，实验动物许可证号：SCXK（沪）2015-0005，由浙江中医药大学实验动物中心[合格证号：SYXK（浙）2013-0184]饲养。饲养期间给予标准饲料及自由饮水，12h黑白循环灯光，恒定温度及湿度。本研究经过浙江中医药大学实验动物管理与伦理委员会审核通过（批准编号：1ACUC-20180326-10）。

1.2 主要仪器和试剂 仪器：PCR仪（美国Applied Biosystems公司）、倒置相差显微镜（德国ZEISS公司）、CO2培养箱（美国 Thermo公司）。试剂：D-半乳糖胺、油红 O 染色液、胰岛素（insulin）、3,3'，5-三碘L-甲状腺原氨酸（T3）、吲哚美辛、地塞米松、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、罗格列酮（rosiglitazone）均购自美国sigma公司；丙泊酚（西安力邦制药有限公司11712011）；RT-PCR 试剂盒（康为世纪公司 10209）；逆转录试剂盒 （TaKaRa ＃AK4802）；RNAiso Plus（TaKaRa 108-95-2）；成骨分化培养基（Gibco 1872976），成软骨分化培养基（Gibco 1867431）；肝细胞生长因子（Peprotech 0510S201），成纤维细胞生长因子（Peprotech 041408-2），胰岛素铁硒传递蛋白（Sigma SLBN1805V）；CCK8试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司032718180410）；茜素红染色液（赛业生物科技有限公司T170113G001）；阿利新蓝染色液(上海源叶生物科技有限公司L06D8G49787)；糖原染色试剂盒（sigma-alorich 061M4347）；小鼠单克隆抗体CD14-PE、CD105-PE以及同型对照PE-IgG2a均购自英国Abcam公司；引物由上海生工生物工程技术有限公司合成。

1.3 急性肝衰竭猪模型建立 两只微型巴马猪实验前按照实验动物标准饲养1周。1只用于制备Nor-ADMSCs。另1只通过颈静脉注射D-半乳糖胺以建立急性肝衰竭模型猪。颈静脉置管前肌肉注射氯胺酮4mg/kg，手术期间通过耳缘静脉施用丙泊酚以2.5mg·kg-1·h-1提供持续麻醉。颈静脉置管和麻醉在30min内完成操作。D-半乳糖胺溶于5%葡萄糖溶液中，用氢氧化钠调节PH至6.8，再以0.22μm过滤器过滤后以1.5g/kg通过颈静脉插管注入[10]。D-半乳糖胺诱导24h后，采用麻醉后放血法处死微型猪。收集血清和肝脏病理组织以检测造模是否成功。

1.4 猪ADMSCs分离、培养 获取微型猪腹部和颈部脂肪组织，分离好的脂肪组织在严格无菌条件下，用4℃含2%青链霉素的磷酸缓冲溶液（PBS）充分洗涤。在含有0.1%胶原酶溶液中充分切碎组织，37℃下消化90min。每隔15min用移液管吹打混匀，以免过度消化。加入低糖培养基终止消化，在室温下离心（700g，10min），弃去上清液。再加入低糖培养基重悬细胞，100目筛网过滤，在室温下离心（700g，10min）后，重新悬浮在含有10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素和链霉素的低糖培养基中。随后将细胞接种到T25培养瓶中，并置于37℃，5%CO2的培养箱中。当细胞达到70%～80%融合时，选择形态均一、生长良好者按1：2或1：3传代，每隔3d换液一次，第3代以后即可用于细胞表型鉴定及分化实验。

1.5 细胞表型鉴定 取第3代猪ALF-ADMSCs和Nor-ADMSCs，用含体积分数为3%胎牛血清的PBS洗涤3次，制成单细胞悬液，调整细胞浓度至5×106/mL，加入荧光标记小鼠单克隆抗体CD14-PE、CD105-PE、CD44-FITC、CD90-FITC、CD29-FITC，PE-IgG2a、FITC-IgG2a、FITC-IgG1 作为同型对照。室温避光孵育30min，PBS洗涤数次后用流式细胞仪检测表面分子标记。

1.6 增殖能力测定 收集第5代对数生长期ALFADMSCs和Nor-ADMSCs，制备单细胞悬液，以每孔2000个细胞接种于96孔板（100μL/孔），并置于37℃，5%CO2的培养箱中培养。培养24h后取出一块96孔板，每孔加入10μL CCK8溶液，随后在CO2培养箱中孵育3h，酶标仪450nm处测定各孔吸光度值（OD值）。每天同一时间取出一块96孔板重复以上操作，连续监测7d，每个时间点重复4次，计算每组细胞OD值。

1.7 多向分化潜能鉴定 取生长状况良好的第4代ALF-ADMSCs和Nor-ADMSCs，接种于6孔板内，每孔1×105个细胞，待细胞达到100%融合后更换为成骨、成脂、成软骨诱导培养基。其中，成骨分化加入成骨诱导培养基，每隔3d换液，连续培养21d后行茜素红S染色。成脂分化诱导培养基配制如下：诱导培养第0d，即第一次加入诱导培养基，在含10%FBS的低糖培养基中加入insulin 5μg/mL，T3 1nM，吲哚美辛 0.125μM，地塞米松 2μg/mL，3-异丁基-1-甲基黄嘌呤 0.5mM，rosiglitazone 0.5μM。诱导培养第 2d，在含10%FBS的低糖培养基中加入insulin 5μg/mL，T3 1nM，rosiglitazone 0.5μM。诱导培养第 4d，在含 10%FBS的低糖培养基中加入insulin 5μg/mL，T3 1nM，rosiglitazone 1μM。第6d诱导培养基同第4d，共诱导8d，可见脂滴形成，并进行油红O染色。成软骨分化加入软骨诱导培养基，每隔3d换液，连续培养21d后行阿利新蓝染色。

诱导结束后用Trizol法提取细胞总RNA，RT-qPCR检测成骨、成脂、成软骨特异性标记物的表达。按照TaKaRa逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录成cDNA（引物序列见表 1）。qPCR采用 UltraSYBR Mixture（Low ROX）说明书进行操作，反应条件如下：预变性：95℃ 10min，变性：95℃ 15s，退火延伸：60℃1min，40个循环。以 GAPDH为内参基因，Nor-ADMSCs和ALF-ADMSCs未分化细胞为对照组，计算两组细胞成骨、成脂、成软骨待测基因2-ΔΔCt值并进行数据处理，每组实验至少重复3次。

1.8 成肝诱导分化及鉴定 参照参考文献[11]的诱导方法，取生长状况良好的第4代ALF-ADMSCs和Nor-ADMSCs，加入肝细胞生长因子20ng/mL，成纤维细胞生长因子20ng/mL，地塞米松40nmol/mL，1%胰岛素铁硒传递蛋白，含5%FBS的低糖培养基，每隔2d换液1次，观察细胞形态，于诱导第21d进行糖原染色，并收集细胞鉴定类肝细胞特异性标志（引物序列见表1）。

1.9 统计学方法 应用GraphPad Prism 6.0软件进行数据分析，所有计量资料数据以均数±标准差（±s）表示，两组间均数比较采用t检验，多组间均数比较采用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 正常猪和肝衰竭猪血清生化及病理学检测结果

正常猪血清学指标如下：丙氨酸氨基转移酶52.100IU/L、天门冬氨酸氨基转移酶53.800IU/L、总胆红素 1.740μmol/L、直接胆红素 1.030μmol/L、血清总蛋白37.980g/L、白蛋白70.800g/L。肝衰竭猪血清学指标：丙氨酸氨基转移酶437.300IU/L、天门冬氨酸氨基转移酶13805.000IU/L、总胆红素32.570μmol/L、直接胆红素24.650μmol/L、血清总蛋白37.840g/L、白蛋白61.500g/L。与正常猪相比，肝衰竭猪血清中丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶、总胆红素、直接胆红素水平显著升高，血清总蛋白及白蛋白降低。正常猪肝组织切片HE染色显示肝小叶结构完整，无肝细胞肿大和坏死。肝衰竭猪肝组织切片可见肝细胞界限不清，呈大片状坏死，坏死区可见炎症细胞浸润，肝窦淤血扩张（见插页图1）。血清学指标及病理组织学表明成功建立猪肝衰竭模型。

表1 引物序列

2.2 细胞形态比较 ALF-ADMSCs和Nor-ADMSCs在接种24h后均可见以散在的方式贴壁生长，以长梭形为主，散在一些多角形、长圆形细胞，细胞增殖较缓慢，原代培养第4d细胞达90%融合（图2A、B）。按1：2传代至第5代时，两组细胞均增殖加速，细胞质丰富，细胞变大而扁平，同时以集落方式生长，呈漩涡状分布（见插页图2C、D）。

2.3 流式细胞表型鉴定比较 流式细胞仪检测结果显示，第 3代 ALF-ADMSCs CD105、CD90、CD14表达阳性率分别为（79.47±6.78）%、（56.83±4.23）%、（0.17±0.05）%。第 3代 Nor-ADMSCs CD105、CD90、CD14 表达阳性率分别为（77.7±4.60）%、（59.47±7.49）%、（0.03±0.05）%。结果表明，ALF-ADMSCs和Nor-ADMSCs均高表达间充质干细胞表面标记CD105、CD90，不表达或低表达干细胞表面标记CD14（见插页图 3）。

2.4 细胞增殖比较 通过CCK8法对第5代ALFADMSCs和Nor-ADMSCs的生长趋势进行了对比分析（表2）。通过比较两组细胞450nm处OD值可以看出，两组细胞的增殖速率十分相似，在第1～2d非常缓慢，处于细胞生长潜伏期，在培养第4d后进入对数生长期，第7d后细胞生长放慢。两组细胞之间差异无统计学意义（P＞0.05）。见表 2。

2.5 多向分化潜能比较 在成骨诱导培养第21d，两组细胞茜素红S染色显示，细胞胞浆内均可见被染为红色的矿化结节（图4A、B）。成脂诱导第8d，两组细胞油红O染色显示，细胞胞浆可见小而圆的红色脂肪滴（图4C、D）。成软骨诱导培养第21d，两组细胞阿利新兰染色可见单个分布的软骨细胞，细胞呈不规则形，胞核呈圆形或椭圆形（见插页图4E、F）。RT-qPCR结果显示，成骨分化21d后ALF-ADMSCs和Nor-ADMSCs中成骨标记物[碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）、骨桥蛋白（osteopontin）]显著增加，脂肪分化8d后ALF-ADMSCs和Nor-ADMSCs中脂肪源性标记物[脂蛋白（LPA）和过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARy2）]均显著增加，软骨分化21d后ALFADMSCs和Nor-ADMSCs中软骨标记物[聚蛋白多糖（Aggrecan）和Ⅱ型胶原蛋白（ColⅡ）]均显著增加（表3）。

表2ALF-ADMSCs和Nor-ADMSCs细胞增殖能力比较（OD 值，±s）

表2ALF-ADMSCs和Nor-ADMSCs细胞增殖能力比较（OD 值，±s）

注：每个时间点重复4次，计算两组细胞OD值；ALF-ADMSCs：急性肝衰竭猪脂肪间充质干细胞；Nor-ADMSCs：正常猪脂肪间充质干细胞

时间（天）1 2 3 4 5 6 7 n 4 4 4 4 4 4 4 Nor-ADMSCs 0.095±0.003 0.129±0.007 0.351±0.006 0.422±0.015 0.679±0.023 1.159±0.099 1.306±0.026 ALF-ADMSCs 0.101±0.004 0.164±0.004 0.380±0.005 0.464±0.012 0.690±0.031 1.238±0.022 1.384±0.034

2.6 成肝分化潜力比较 ALF-ADMSCs和Nor-ADMSCs诱导21d后，均可见不规则多边形的类肝细胞形成，糖原染色可见细胞胞浆内紫色沉淀（见插页图 5）。

RT-qPCR检测ALF-ADMSCs和Nor-ADMSCs成肝分化后两组细胞白蛋白（ALB）、肝细胞生长因子（HGF）、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）、肝细胞核因子-1A（HNF1A）和肝细胞核因子-1B（HNF1B）等肝细胞特异性标记物的表达，结果显示，ALFADMSCs和Nor-ADMSCs均高表达肝细胞表面标记物，但两组细胞间表达差异无统计学意义（P＞0.05）。

表3 两组细胞成骨、成脂、成软骨及成肝分化后特异性基因相对表达量（2-ΔΔCt值，±s）

表3 两组细胞成骨、成脂、成软骨及成肝分化后特异性基因相对表达量（2-ΔΔCt值，±s）

注：每个基因重复检测 3 次，计算 2-ΔΔCt值。alkaline phosphatase：碱性磷酸酶；osteopontin：骨桥蛋白；Aggrecan：聚蛋白多糖；ColⅡ：Ⅱ型胶原蛋白；LPA：脂蛋白；PPARy2：过氧化物酶体增殖物激活受体；ALB：白蛋白；G6PD：葡糖糖-6-磷酸脱氢酶；HGF：肝细胞生长因子；HNF1A：肝细胞核因子-1A；HNF1B：肝细胞核因子-1B；ALFADMSCs：急性肝衰竭猪脂肪间充质干细胞；Nor-ADMSCs：正常猪脂肪间充质干细胞

基因alkaline phosphatase osteopontin Aggrecan colⅡLPA PPARy2 ALB G6PD HGF HNF1A HNF1B n 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 Nor-ADMSCs 3.241±0.062 2.903±0.584 2.702±0.601 5.411±1.301 74.242±8.383 5.802±0.222 2.603±0.321 2.831±0.382 2.432±0.532 2.014±0.303 2.512±0.164 ALF-ADMSCs 3.592±0.250 4.262±0.560 1.761±0.322 4.633±0.651 56.234±8.461 4.072±0.160 2.801±0.622 2.733±0.111 2.021±0.212 2.170±0.011 2.291±0.164

RT-qPCR检测未分化ALF-ADMSCs和Nor-ADMSCs中肝细胞特异性基因的表达，结果显示，与Nor-ADMSCs相比，ALF-ADMSCs中HGF的表达高于 Nor-ADMSCs （12.48±0.59）倍（P＜0.01）。ALB、HNF1A、HNF1B、G6PD的表达两组细胞差异无统计学意义（P＞0.05）。见表 4。

3 讨论

间充质干细胞可通过免疫调节、抗炎作用、旁分泌作用以及体内直接分化为肝细胞样细胞，从而促进肝再生，发挥治疗终末期肝病的作用[12]。研究表明，67（±0.8）mL大腿外侧脂肪抽吸物中可得到12.31（±1.2）×106间充质干细胞，ADMSCs获取方便，细胞产量相当可观，在MSC治疗肝脏疾病中引起了极大的关注[13]。多项急性肝衰竭动物模型表明，脂肪来源的MSCs可显著改善模型动物的肝脏血清学指标，病理组织形态及生存率等[14-15]。

本研究主要比较两种来源的ADMSCs的体外特征。结果显示，两组细胞形态并无差异，增殖能力相似，多向分化潜能相当，且均高表达间充质干细胞表面分子标记物，低表达造血干细胞标记物。ALFADMSCs可在体外诱导分化为类肝细胞，与Nor-ADMSCs相比，两者成肝分化潜能相当。本研究结果显示，ALF-ADMSCs高表达HGF。HGF具有抗细胞凋亡、抗纤维化和促细胞再生的功能，在肝细胞的发育和再生中起着不可替代的作用，其为各种组织来源的干细胞体外分化为肝细胞提供微环境，并且是分化为类肝细胞的关键因素。提示我们，ADMSCs在肝衰竭微环境的影响下高表达HGF，这将为细胞自体移植治疗终末期肝病提供依据。

表4ALF-ADMSCs和Nor-ADMSCs中肝脏特异性基因的表达量（2-ΔΔCt值，±s）

表4ALF-ADMSCs和Nor-ADMSCs中肝脏特异性基因的表达量（2-ΔΔCt值，±s）

注：与 Nor-ADMSCs比较，**P＜0.01。每个时间点重复 4 次，计算 2-ΔΔCt；ALF-ADMSCs：急性肝衰竭猪脂肪间充质干细胞；Nor-ADMSCs：正常猪脂肪间充质干细胞；ALB：白蛋白；HNF1A：肝细胞核因子-1A；HNF1B：肝细胞核因子-1B；HGF：肝细胞生长因子；G6PD：葡糖糖-6-磷酸脱氢酶

基因ALB HNF1A HNF1B HGF G6PD n 3 3 3 3 3 Nor-ADMSC 1.000±0.060 1.000±0.060 1.000±0.060 1.000±0.060 1.000±0.060 ALF-ADMSC 0.791±0.145 1.524±0.132 1.502±0.291 12.484±0.593**0.764±0.082

综上所述，肝衰竭不影响ADMSCs的细胞形态学，增殖能力，MSC特异性标记物的表达以及多向分化潜能。但ALF-ADMSCs可在体外高表达HGF，与Nor-ADMSCs体外成肝分化潜能相比，二者却并无差异。有文献报道[16]，过表达HGF的ADMSCs可显著改善辐射诱导的大鼠肝损伤模型，增强ADMSCs的治疗潜力，因此，还需在体内继续验证急性肝衰竭来源的ADMSCs是否优于正常供者来源的ADMSCs，进一步明确来自肝损伤患者的ADMSCs是否以某种方式改变进而影响其治疗潜能。