复方黄芪养心合剂对大鼠缺血心肌缝隙连接蛋白CX43磷酸化的影响

闪书华 李梦茜 祝 丹 陈启兰

心肌缺血（myocardial ischemia）是指在各种因素作用下心肌血供减少，或者心肌最大供血量无法满足需氧量，引起心肌能量代谢、心脏功能、结构发生异常的病理状态[1]。冠状动脉粥样硬化性心脏病简称冠心病（coronary heart disease，CHD）又被称为缺血性心脏病，临床上心肌缺血主要是由于冠状动脉病变所致，而心肌缺血的发展则可加重CHD的进程严重者可引起猝死。本研究观察复方黄芪养心合剂（compound astragalus mixture nourishing heart，CAMNH）对大鼠心肌缺血后心肌缝隙连接蛋白CX43的预干预作用。

1 实验材料

1.1 实验动物 清洁级雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠50只，体质量180～200g，由上海斯莱克公司提供，合格证号：SCXK（沪）2017-0005。委托浙江中医药大学动物实验中心饲养，实验动物许可证号：SYXK（浙）2018-0012。

1.2 实验药品 CAMNH：黄芪、党参、太子参、苦参、丹参、甘松各20g，炙甘草10g，生山楂15g。制备成生药浓度为2g/mL的生药煎剂。中药饮片由杭州市中医院西药库房提供。琥珀酸美托洛尔缓释片（Metoprolol Succinate Sustained-release Tablets，MSSRT）[47.5mg/片，批号 J20150044，阿斯利康（无锡）制药有限公司]。

1.3 主要试剂和仪器 CX43（磷酸化位点s368）抗体（abcam,美国，ab30559）；蛋白 Marker（Thermo,美国，26617）；BCA 试剂盒（普利莱，北京，PLL-2016-11）；Western Blot膜再生液（普利莱，北京，2018J1KP1650）；蛋白磷酸酶抑制剂（普利莱，北京，21171126）；戊巴比妥钠（上海西唐生物科技有限公司，30102LD）；酶联免疫检测试剂盒（R&D公司，R1080115、R9080115）；DH-150动物人工呼吸机（浙江大学医学仪器厂）；Medlab-U/4CS生物信号采集仪（南京美易科技有限公司）；酶联免疫检测试剂盒（R&D公司）。

2 实验方法

2.1 冠状动脉结扎术后心肌缺血模型大鼠的建立急性心肌缺血模型大鼠制作参考Supinsk等[2]的方法并加以改进。大鼠用2%戊巴比妥钠（2mL/kg）麻醉后，固定于鼠板，气管插管连接动物呼吸机，逐层开胸，剪断第3～4肋骨，以扩胸器撑开胸腔，撕破心包膜，轻轻掀起左心耳，结扎冠状动脉左前降支，结扎1h后留取标本。假手术组除不结扎外其余步骤相同。全程记录Ⅱ导联心电图。

2.2 分组及给药 50只大鼠按随机数字表法分为CAMNH大剂量组、CAMNH小剂量组、MSSRT组、模型组、假手术组，每组10只。CAMNH大剂量组中药按 28g（14mL·kg-1·d-1）剂量灌胃；CAMNH 小剂量组中药按 7g（3.5mL·kg-1·d-1） 剂量灌胃；MSSRT 组：MSSRT 蒸馏水溶解后按 9.5g（7mL·kg-1·d-1）剂量灌胃；模型组和假手术组用生理盐水按7mL·kg-1·d-1剂量灌胃，共计2周。

2.3 指标检测

2.3.1 心电图 大鼠麻醉固定后连接心电图，造模过程中全程记录Ⅱ导联心电图。

2.3.2 心肌肌钙蛋白T（cTn-T）和肌钙蛋白I（cTn-I） 造模结束后腹主动脉取血3mL，离心之后取血清。根据ELISA试剂盒的说明书进行操作，测定cTn-T和cTn-I水平。

2.3.3 HE染色观察 造模完成，取血结束后，下腔静脉注入2%Evans blue，取下大鼠心脏组织，生理盐水冲洗干净后，仅保留左心室，沿与心肌长轴垂直的方向切开，将心肌组织分为3块，厚度约2～3mm，取1个组织块置于福尔马林溶液内固定24h。其余组织块放于冻存管中-80°保存。

HE染色：组织固定好后，置于病理组织脱水机中进行脱水、透明、浸蜡，然后取出标本进行石蜡包埋，切片，70℃烤箱烤片1h，二甲苯脱蜡，各级酒精脱二甲苯，苏木素染色，盐水乙醇分化，伊红复染，常规脱水、透明，中性树脂封片，光学显微镜读片。病理图文系统采集图像（40×）。

2.3.4 WB法测定CX43表达量 蛋白提取：称取100mg心肌组织，放于玻璃研磨棒内，加入400μL已加蛋白酶抑制剂和蛋白磷酸酶抑制剂的蛋白裂解液（RIPA）中，冰上研磨至组织完全裂解，倒入EP管中，冰上静置 30min。4℃，10 000g，离心 20min，取上清。采用BCA法测定蛋白浓度，取适量蛋白加入上样缓冲液和RIPA配平蛋白浓度后，100℃水浴5～10min，冷却至室温后-20℃保存。

蛋白电泳：制作5%分离胶、10%浓缩胶加入蛋白样品进行电泳，电泳结束制作“三明治”将蛋白转移至PVDF膜上，5%牛血清白蛋白（BSA）封闭2h，加入一抗4℃过夜，TBST洗膜3次，每次10min，加入荧光二抗封闭1.5h，再次TBST洗膜后显影仪显影,膜再生后加入内参GAPDH显影，计算条带灰度值进行比较。

2.3.5 统计学方法 应用SPSS19.0软件进行统计分析。计量资料用均数±标准差（±s）表示，采用单因素方差分析。P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 实验动物存活情况 大鼠灌胃过程中死亡2只，造模过程中死亡10只，总存活率为76%。每组留取6只血标本及心脏组织，其余大鼠造模结束后留取心脏组织进行心脏双染。

3.2 心电图改变 冠脉结扎前，大鼠心率在300次/min以上，心电图波形正常；冠状动脉左前降支结扎即刻Ⅱ导联心电图可见R波振幅抬高，ST段上抬明显，甚至T波、ST段与R波融合成单向曲线，持续至手术结束，证明造模成功，见插页图1。

3.3 各组大鼠cTn-I、cTn-T比较 cTn-I：模型组与假手术组相比，cTn-I值明显增高（P＜0.01）；MSSRT组与模型组、假手术组比较均减少（P＜0.05，P＜0.01）；CAMNH小剂量组与假手术组相比明显增高（P＜0.01），与模型组相近，两者差异无统计学意义（P＞0.05），与 MSSRT 组相比增高（P＜0.05）；CAMNH 大剂量组与模型组相比明显减少（P＜0.01），与CAMNH小剂量组相比增加幅度减少（P＜0.05），与MSSRT组相当，差异无统计学意义（P＞0.05）。cTn-T：模型组与假手术组相比明显增高，（P＜0.01）；MSSRT组与模型组比较明显降低（P＜0.01）；CAMNH小剂量组与假手术组相比明显增高（P＜0.01），与模型组相比增加程度减小（P＜0.01），与 MSSRT 组相比增高（P＜0.05）；CAMNH大剂量组与假手术组相比明显升高（P＜0.01），与模型组相比明显减少（P＜0.01），与 CAMNH小剂量组相比减少（P＜0.05），与MSSRT组作用相近（P＞0.05）。见表 1。

表1 各组冠状动脉结扎术后心肌缺血模型大鼠血 cTn-I、cTn-T 比较（ng/L±s）

表1 各组冠状动脉结扎术后心肌缺血模型大鼠血 cTn-I、cTn-T 比较（ng/L±s）

注：与假手术组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与 MSSRT 组比较，▲P＜0.05；与 CAMNH 小剂量组比较，☆P＜0.05；CAMNH：复方黄芪养心合剂；MSSRT：琥珀酸美托洛尔；cTn-I：心肌肌钙蛋白I；cTn-T：心肌肌钙蛋白T

组 别CAMNH大剂量组CAMNH小剂量组MSSRT组模型组假手术组鼠数6 6 6 6 6 cTn-I 81.63±16.89△△☆115.07±21.34**▲85.48±24.06*△△144.94±28.83**58.50±9.53 cTn-T 100.20±5.66**△△☆121.33±15.02**△△▲97.89±11.78*△△144.33±20.29**77.40±12.52

3.4 病理形态观察 摘取大鼠心脏时肉眼可见假手术组大鼠整颗心脏蓝染，其余各组心脏缺血心肌未蓝染，与正常心肌组织区分明显。HE染色光镜下可见CAMNH大剂量组、CAMNH小剂量组、MSSRT组、模型组心肌缺血出现细胞形态学改变，细胞界限不清，胞质弥散，出现核固缩及溶解，甚至肌细胞排列结构消失；非缺血区细胞结构清晰，心肌纤维排列整齐；缺血区与非缺血区区分明显。假手术组心肌细胞胞浆染色均匀，未见胞质溶解，胞核清楚，心肌纤维排列整齐，无炎性细胞浸润，毛细血管正常。见插页图2。

3.5 各组大鼠心肌组织磷酸化CX43变化 模型组与假手术组相比磷酸化CX43蛋白的表达量明显降低（P＜0.01）；MSSRT 组与假手术组、模型组相比蛋白磷酸化表达明显增加（P＜0.01）；CAMNH小剂量组与假手术组磷酸化表明显减少（P＜0.01），在抑制磷酸化蛋白表达减少方面明显较MSSRT组差（P＜0.01），与模型组相比磷酸化表达增加（P＜0.05）；CAMNH大剂量组与假手术组比表达量明显减少（P＜0.01），与MSSRT组在减少磷酸化蛋白表达降低的作用上程度相当（P＞0.05），与CAMNH小剂量组、模型组比增加了磷酸化的蛋白量（P＜0.05）。见插页图3、表2。

表2 各组冠状动脉结扎术后心肌缺血模型大鼠心肌组织磷酸化 CX43（ser368）蛋白表达量比较（±s）

表2 各组冠状动脉结扎术后心肌缺血模型大鼠心肌组织磷酸化 CX43（ser368）蛋白表达量比较（±s）

注：与假手术组比较，★★P＜0.01；与模型组比较，☆P＜0.05，☆☆P＜0.01；与MSSRT 组比较，△△P＜0.01；与 CAMNH 小剂量组比较，▲P＜0.05；CAMNH：复方黄芪养心合剂；MSSRT：琥珀酸美托洛尔；CX43：心肌缝隙连接蛋白43

组 别CAMNH大剂量组CAMNH小剂量组MSSRT组模型组假手术组鼠数6 6 6 6 6 CX43 0.13±0.02★★☆▲0.10±0.02★★☆△△0.13±0.01★★☆☆0.07±0.01★★0.18±0.02

4 讨论

心肌缺血是多种心脏疾病发生的主要原因，随着缺血时间的延长，可出现急性冠脉综合征、心力衰竭等症状，严重者可发生猝死。本实验采用结扎冠状动脉左前降支的方法制造急性心肌缺血模型大鼠，与临床发生心肌缺血的机制最为接近，造模成功率和大鼠存活率也高，是一种比较成熟的造模方法[3-5]。采用在体注射Evans blue的方法进行染色，比离体染色更能反映心肌缺血的程度[6]。多项研究证明琥珀酸美托洛尔缓释片用于早期急性心肌缺血，可以减少心律失常的发生，缩小梗死面积，降低死亡率[7-8]。温华知等[9]研究证实美托洛尔能够改善梗死区缝隙连接蛋白，发挥其抗心律失常的作用。

肌钙蛋白是心肌损伤的标志物，其敏感性、稳定性远高于心肌酶谱[10]，cTn-I是诊断心肌损伤的“金指标”[11]，美国心脏病学会（ACC）在对急性心肌梗死的定义中也将cTn-T增高作为心肌损伤的最主要条件。郝迪等[12]的研究经证实冠心苏合胶囊可以降低急性心肌梗死大鼠的cTn-T，降低梗死心肌质量百分比。曹志伟[13]的研究证实参麦注射液对于冠心病所造成的心肌缺血情况可以降低肌钙蛋白，减少心肌损伤，改善微循环。本研究发现复方黄芪养心合剂大剂量组可以降低心肌肌钙蛋白升高的程度，其作用效果与琥珀酸美托洛尔缓释片相当，其作用效果或与剂量有一定相关性。

缝隙连接由连接蛋白（connexins，Cxs）构成，又称间隙连接（gap junction，GJ）。相邻的细胞可以通过缝隙连接进行信息、物质和能量的交换，对细胞的新陈代谢、内环境稳定、增值和分化等生理过程起着重要的调控作用[14-15]。Cx43在心脏中主要分布于心室肌细胞中，Cx43是最易降解的结构蛋白之一，在正常状态下以磷酸化的形式存在，当心肌缺血发生时，心肌细胞中的Cx43被大量降解，发生去磷酸化，从而导致心肌细胞间失电耦联，引起传导阻滞和折返性传导，继发心律失常，甚者可导致死亡[16-17]。龚一萍等[18]研究证实复脉汤等益气活血药物可以通过抑制心肌梗死后CX43去磷酸化，稳定心梗后细胞间电耦联，从而对梗死后缺血心肌起到保护作用。李真真等[19]研究证实黄芪甲苷可以通过逆转CX43去磷酸化及表达分布紊乱，发挥抗心律失常作用，对心肌梗死起到保护作用。CAMNH由八味中药组成，方中黄芪、党参、太子参可补益心气，丹参、生山楂活血，甘松、苦参理气清热，炙甘草可益气和中、调和诸药，全方起到益气活血化瘀之功效。本研究证明与模型组相比CAMNH可以减小磷酸化CX43的降低幅度，作用与MSSRT相当。其改善心肌缺血的症状或与维持CX43磷酸化状态，稳定细胞间电耦联有关。

本研究结果显示，复方黄芪养心合剂能显著降低结扎冠状动脉左前降支所致的心肌缺血模型大鼠心肌肌钙蛋白升高幅度，减少CX43去磷酸化程度，其作用强度或与剂量大小存在一定关系。