秦小林
酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)是20世纪70年代发展起来的一种酶联免疫测定技术,因其敏感度和特异度较高、操作简便、重复性好等优点,已广泛应用于疾病诊断、科研等医学领域。目前血站使用ELISA法和核酸检测法(nucleic acid testing,NAT)进行血液筛查,并发布血液检测的最终结果,医院不再进行复查。因此,为保障患者用血安全,血站应重视试剂的选择和检测过程中关键控制点的掌握。现将本站2017—2018年血液检测待查标本再检情况报告如下。
1.1 标本来源 收集2017—2018年本站8种ELISA检测试剂检测的待查标本1 402份,均为单边阳性标本。两种不同厂家试剂检测同一项目时,只要检测结果不相符即判为待查标本。
1.2 仪器与试剂 全自动酶联免疫一体机Uranus AE180(深圳爱康生物科技有限公司),EVO全自动加样仪(瑞士TECAN公司),后处理FAME 24/20(烟台澳斯邦生物工程公司);核酸检测系统及其试剂盒(中山大学达安基因股份有限公司),核酸检测系统及其试剂盒(苏州华益美生物科技有限公司);乙型肝炎(乙肝)表面抗原〔(hepatitis B surface antigen,HBsAg),英国雅培和北京万泰〕,梅毒抗体(北京万泰和上海科华),丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)抗体(上海科华和厦门英科新创),人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)抗体(法国伯乐和北京金豪),所有试剂均通过中国药品生物制品检定所批检。
1.3 方法 分析本站8种ELISA检测试剂检测待查情况,对相应待查项目用同种试剂进行两孔再检。只要有一孔呈反应性即判为阳性,两孔均为无反应性则判为阴性。对待查检测阴性的标本再采用荧光聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)方法进行核酸8份标本混样检测。
2.1 HBsAg试剂检测结果待查情况 雅培HBsAg试剂总待查率高于万泰,其中雅培待查阳性率低(15.77%),待查阴性率高(84.23%);万泰待查阳性率高(64.69%),待查阴性率低(35.31%)。见表1。
表1 某血站1 402份待查标本HBsAg试剂检测结果待查情况
2.2 抗-HCV试剂检测结果待查情况 科华抗-HCV试剂待查数约为新创HCV待查数的2倍,待查阳性率相差不大。见表2。
表2 某血站1 402份待查标本抗-HCV试剂检测结果待查情况
2.3 抗-HIV试剂检测结果待查情况 金豪抗-HIV试剂待查阳性率高(67.57%),伯乐待查阳性率较低(39.45%)。见表3。
表3 某血站1 402份待查标本抗-HIV试剂检测结果待查情况
2.4 梅毒抗体试剂检测结果待查情况 万泰梅毒抗体试剂待查数是科华梅毒抗体试剂待查数的3倍,且待查阳性率也比科华高。见表4。
表4 某血站1 402份待查标本梅毒抗体试剂检测结果待查情况
2.5 ELISA待查阴性标本核酸检测结果情况 雅培HBsAg试剂待查阴性标本核酸检测阳性率最高(0.84%)。见表5。
表5 HBsAg、抗-HCV、抗-HIV ELISA待查阴性核酸检测情况
相关调查显示,我国乙肝病毒(hepatitis B virus,HBV)携带者约为1.2亿,感染率高达60%,HBsAg携带者亦高达10%~15%[1]。本研究显示,HBsAg总待查率达待查总数的70.61%,可能与我国是HBV高发区有关。8种ELISA检测试剂检测待查中雅培HBsAg试剂待查数最多,占待查总数的50.21%,但其再检阳性符合率仅15.77%;而金豪抗-HIV试剂、万泰HBsAg试剂和万泰梅毒抗体试剂再检阳性符合率均大于60%;新创抗-HCV、伯乐抗-HIV、科华抗-HCV和科华梅毒抗体试剂再检阳性符合率为30%~40%。雅培HBsAg试剂再检符合率低可能与雅培检测试剂盒的诸多影响因素有关。雅培试剂敏感度高,截断值较低(约0.090),洗板不干净即可出现花板,其次加样、孵育温度和时间、显色、试剂、环境、操作、类风湿因子、补体以及离心速度和时间等因素也会导致结果呈假阳性和假阴性[2-3]。有研究表明,以3 600 r/min(2 898 g)离心10 min分离血清,血清中HBsAg含量假阳性率为9.82%;以8 819 r/min(10 000 g)离心10 min分离血清,不会导致假阴性标本出现[4]。可见同一批标本可以通过提高标本离心速度减少假阳性结果,而本室常规ELISA检测标本的离心时间为5 min、速度为3 000 r/min,因此为减少HBsAg待查标本数,必须在检测前将标本以足够的时间和速度离心。万泰HBsAg试剂、万泰梅毒抗体试剂和金豪抗-HIV试剂再检阳性率高可能还与试剂本身有关,国产ELISA试剂盒的敏感度较进口试剂盒稍差,但特异度和重复检出率均高[5]。相关文献显示,ELISA筛查单试剂反应性献血者中,潜在合适献血者占较大比例,广西南宁及河南新乡地区的追踪调查结果显示,单试剂反应性献血者中潜在合适献血者比例分别为86.6%、58.3%[6-7]。也有文献报道,ELISA检测HBV、HCV单试剂阳性,其假阳性率较高,单试剂检测阳性标本及抗-HCV灰区标本中均未检出核酸反应性标本,171例HBsAg灰区标本中检出HBV-DNA反应性标本6例,247例HCV未检出HCV-RNA反应性标本[8]。因而万泰HBsAg、万泰梅毒抗体试剂和金豪抗-HIV试剂存在假阳性率较高的情况。新创抗-HCV、伯乐抗-HIV、科华抗-HCV和科华梅毒抗体试剂再检阳性符合率均在30%~40%,特异度比较符合本站血液筛查要求。另外,表5数据显示,雅培HBsAg再检阴性标本核酸检测阳性率高达0.84%,而我国经NAT法检测后 HBsAg(-)NAT(+)检出率约为 1:2 000,其中约80%为隐匿性乙肝病毒感染(occult hepatitis B virus infection,OBI),20% 为窗口期标本[9-10]。本血站所用雅培HBsAg在再检阴性标本中,核酸检测阳性率远高于我国 HBsAg(-)NAT(+)检出率,因而在雅培HBsAg单边待查标本中极可能存在高风险OBI感染。有研究表明,乙肝核心抗体阳性健康体检人群中,HBV-DNA阳性率为6.8%[11],尽管继HBsAg检测之后已引入NAT检测,但在抗-HBc(+)合格献血者血液中仍有一定机率含微量HBV-DNA,故需进一步提高核酸检测的敏感度。
血站实验室进行血液筛查的目的是为防止通过输血感染病原体,而非进行诊断,故对检测方法敏感度的要求高于特异度。然而敏感度和特异度本身就是一对矛盾的变量,两者随诊断临界值的变化而变化,过高的检测敏感度势必会削弱其特异度,导致误诊率上升[12]。对血站而言,就会导致因假阳性被屏蔽的献血者数量增多,造成献血人群的流失。而我国尚未要求对单边阳性或核酸阳性的结果作进一步验证,对于检测出现的阳性结果,本站未开展确证试验而无法及时得到证实。单试剂假阳性不仅直接导致了血液资源的浪费,削弱了无偿献血者的队伍,还对因假阳性结果遭拒的献血者身心造成了伤害,对无偿献血事业的健康发展造成了不利影响。因此,血站应对ELISA检测单边阳性或核酸阳性献血者进行追踪调查,为之后献血者的归队问题作出前瞻性统计数据分析,避免上述情况的发生。