禽白血病病毒基因组和检测方法研究进展

曾依翎 相雪莲 许丹宁 曹 楠

（1.仲恺农业工程学院动物科技学院，广东 广州 510225；2.广东省水禽健康养殖重点实验室，广东 广州 510225）

Gag基因编码病毒内部非糖基化结构的蛋白，包括衣壳（Capsid，CA，p27）、基质蛋白（Matrix，MA，p19）、p10、核衣壳（Nucleocapsid，NC，p12）和蛋白酶（Protease，PR，p15）。此类蛋白在各亚群中具有高度保守性，其中国内外许多检测ALV的ELISA方法便是基于p27基因的高度保守性［11］。p27基因表达ALV的衣壳蛋白上有多个具有活性的抗原位点，研究发现p27蛋白可与细胞中的GRP78蛋白结合，在病毒进入细胞、抗原呈递、细胞信号传导等方面发挥重要作用，与感染ALV的鸡群产生免疫抑制有重要关联，然而两者之间的作用机理还有待研究［12］。

Pol基因编码病毒的整合酶（Integrase，IN，p32）与反转录酶（Reverse Transcriptase，RT）。ALV致密的核心内含有反转录酶和整合酶，其中反转录酶将病毒RNA反转录为前病毒DNA，整合酶再将病毒DNA整合进宿主染色体，因此pol基因对于病毒的复制有重要作用。最新研究发现，pol基因的突变导致ALV-K毒株的逆转录酶活性、复制能力和垂直传播能力都有了明显的增强，并且这种突变具有稳定的遗传性，揭示着pol基因在ALV的传播上的重要作用。

Env基因编码病毒的囊膜糖基化蛋白，其中gp85基因编码的膜表面糖蛋白亚单位（Surface Glycoproteinunit，SU）和gp37基因编码的跨膜糖蛋白亚单位（Transmenbrance Protein，TM）二者连接组合形成杆状的二聚体，附着于囊膜表面，即病毒糖蛋白。SU决定宿主范围和亚群特异性［13］，序列中心区域含有高变区（Hypervariable Region）hr1、hr2和可变区（Variable Region）vr1、vr2、vr3［14］，

禽白血病病毒（Avian Leukosis Vius，ALV）可以引起禽类多种具有传染性的良性和恶性肿瘤性疾病，具有感染率高但发病率低的特点［1］。感染禽白血病病毒的临床表现包括血管瘤、髓细胞样白血病、成髓细胞白血病、成红细胞性白血病、结缔组织性肿瘤、骨硬化病及淋巴细胞性白血病等［2-3］。ALV对养禽业造成的危害是多方面的：一是直接发病，病鸡产生肿瘤，最终死亡；二是免疫抑制，发病鸡继发多种疾病，对疫苗免疫应答差，生产性能受到严重影响［4-5］；三是危害子代鸡，祖代或父母代鸡一旦发病，将严重影响雏鸡的质量［6］。ALV可以通过母鸡的生殖系统传染给子代，使雏鸡在出生时便带毒，排出的胎粪又能水平传播，传染整个雏鸡群，因此日龄越小的鸡群越容易通过水平传播感染。更有报道从鸡场工作人员体内检测出了ALV抗体，说明ALV对公共卫生存在潜在威胁［7］。

1 禽白血病病毒基因组研究进展

ALV属于禽α反转录病毒属，根据病毒的囊膜蛋白特性等将ALV分为A～J 10个亚群［8］，以及新发现的K亚群［9］。其中，从鸡分离到的有7个亚群［10］，分别为A、B、C、D、E、J、K亚群。

ALV对热不稳定，对脂溶性溶剂敏感，对紫外线有一定抗性。电镜下病毒颗粒为球形，直径80～145 nm，表面有约8 nm纤突，外层由囊膜包裹，囊膜表面有穿膜蛋白和表面蛋白，决定病毒的宿主范围，致密的核心呈二十面体，含二倍体RNA、反转录酶、整合酶等复制所需组分。

ALV基因组全长7.6～7.8 kb，为典型的慢转化型反转录病毒序列结构，全基因组序列为5’-R-U5-gag-pol-决定了病毒的特异性和中和活性，两端较为保守。由gp37编码的TM在N端与C端各含有一个疏水区，介导病毒与细胞膜的融合过程。研究发现，gp37的部分序列差异将Env分为3种，分别为抑制型Env、活跃型Env和双功能型Env［15］。

ALV上的SU与宿主细胞上的受体相结合，引发TM的构象变化从而介导病毒囊膜与细胞膜融合，在细胞质内释放核心；核心内的反转录酶以病毒RNA为模板合成前病毒DNA，此时形成RNA:DNA杂交链；RNA酶H降解病毒RNA，以病毒DNA为模板合成新的病毒DNA，此时形成DNA双链；线型的双链DNA进入细胞核，在整合酶的作用下插入宿主的染色体中；病毒DNA两端的长末端重复序列（Long Terminal Repeat，LTR）具有转录增强子和启动子的作用［16］，利用细胞内的物质合成组装新病毒，最终释放至细胞外，继续感染其他宿主细胞。

2 禽白血病检测和诊断研究进展

2.1 临床诊断

临床上ALV的感染会引起鸡群生长缓慢、生产性能下降，继发感染马立克氏病，部分发病鸡产生肿瘤最终死亡，这些症状一般在鸡感染禽白血病后一段时间才会发生。解剖病鸡部分可见血管瘤、脾脏肿大、胸骨肋骨肿瘤结节、胸腺萎缩和淋巴瘤等典型症状。然而，更多临床案例表明，禽白血病常与马立克氏病、传染性法氏囊病等鸡的免疫抑制病混合感染［12］，鸡群感染率高，发病较低，感染鸡能在鸡群中扩散病毒，使鸡群整体带毒，最终降低生产性能，给养鸡业带来巨大的经济损失。临床诊断法不能及时检测出鸡群中的带毒鸡，只有当鸡群发病时才能进行诊断，而且由于混合感染，仅靠临床手段难以确诊，因此必须结合病毒分离、酶联免疫等分子诊断方法，才能确诊禽白血病。

2.2 病毒分离

ALV的分离一般采用DF-1细胞或CEF细胞，研究表明DF-1细胞在分离率与准确率上均优于CEF细胞［17］。无菌采集含ALV的病料，包括血清、血浆、泄殖腔棉拭子、蛋清、精液、肿瘤病灶、肝和脾等，研磨后经0.22 μm的滤器过滤，接种至长满单层的DF-1细胞，培养7～9 d后即可通过免疫荧光、酶联免疫吸附试验或者荧光定量等方法检测培养液中的病毒含量，确定病料中是否含有ALV。病毒分离法检测ALV是最为可靠的诊断方法，但该方法需要实验室条件，对操作人员要求较高，且花费时间较长，不适合大量样品的检测。

2.3 聚合酶链式反应

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）被广泛应用于诊断领域，具有特异性强、灵敏性高、较为快速等特点。早期人们根据ALV的测序比对结果，选取亚群间相对保守又有所差异的片段设计引物，通过扩增病毒样品的前病毒DNA或者RNA，能快速对ALV进行鉴定与分型［17］，结合临床症状与组织病理学诊断，可以对病鸡做出初步诊断。

2.4 实时荧光定量PCR

由于PCR检测ALV的诊断方法在灵敏性、时效性等方面存在不足，研究人员对PCR诊断方法进行改良，建立了ALV-J荧光定量PCR法（Real-time Quantitative Polymerase Chain Reatcion，qPCR）［18-19］。该方法以ALV-J上高同源性的序列作为TaqMan探针，特异性序列为引物，特异性扩增病毒片段。TaqMan探针上带有淬灭基团跟荧光基团，仅在结合特定序列时发出荧光，因此该方法特异性高，还能进行定量分析。研究利用阳性模板建立标准曲线，不仅可以鉴定样品的ALV-J阳性率，还可以确定样品中病毒的拷贝数。结果证明该检测方法具有良好的特异性，与SYBR Green I相比假阳性率更低。比起常规PCR法检测ALV-J，该qPCR法可以检测出最低3.2×102拷贝/μL的ALV-J，灵敏性有巨大的提高［18］。采用qPCR法能更灵敏、快速地检测出ALV-J，且耗费样品少、特异性极高，可以排除禽流感病毒、ALV-A、ALV-B、马立克氏病病毒等病毒的干扰，适用于检测血清、粪便、脾、肺、气管等组织。相比于传统血清学方法检测ALV，qPCR法耗时更短、准确率更高、重复性好，为快速检测和准确定量提供良好的支持。

2.5 酶联免疫吸附试验

酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA）是针对ALV抗原与抗体的结合特点进行设计的，可以大批量检测样品中ALV的抗原或抗体水平，且操作简洁、快速，重复性良好，适合推广应用于鸡场净化工作［20］。适用的病料包括蛋清、细胞液、公鸡精液、泄殖腔棉拭子等［21］，通常采用各亚群相似性良好的p27蛋白或特异性高的gp85蛋白制备抗体包被酶标板，检测样品中的抗原水平，反应值高于阈值时判断样品为ALV阳性。然而，该方法检测出的阳性样品包含内源性ALV的样品，内源性ALV不引起鸡的发病，属于假阳性，因此净化工作会对鸡场造成一定损失。而且gp85基因含有高变异区，各分离株相似性低，采用单一毒株的gp85基因制备的抗体易存在覆盖率低的问题［22］。在国外，检测ALV-J的特异性膜蛋白gp85的ELISA试剂盒已商品化，但其价格昂贵，且包被的gp85蛋白与我国各地区的ALV-J毒株的gp85蛋白具有较大差异，准确率不足，因此难以得到推广。国内也先后建立了多个ALV-J gp85蛋白检测方法［23］，然而毒株覆盖率较低、成本较高的问题仍未得到解决，不适宜推广。

2.6 间接免疫荧光试验

间接免疫荧光试验（Indirect Immunofluorescence As-say，IFA）是将带荧光标记的特异性单克隆抗体与抗原反应，可以用来确定ALV的亚群，属于血清学诊断的范畴。1979年，Payne等建立了禽白血病gs抗原的荧光抗体检测方法［24］，而后Qin等也研制出针对ALV-J的单克隆抗体［25］，可以特异性地检测ALV-J。该检测方法由于技术要求较高，对成本与操作人员要求较高，不适合鸡场进行大批量样品检测，因此属于实验室诊断的范畴。

2.7 环介导等温扩增技术

环介导等温扩增技术（Loop-mediated IsothermalAmplification，LAMP）是一种新兴的分子生物学检测方法，针对ALV多个区域设计特异性引物，采用一种链置换DNA聚合酶，在等温条件下静置1～2 h即可完成扩增反应。不同于PCR技术，LAMP不需要经过长时间的扩增反应与电泳操作，具有灵敏性高、特异性强、操作简单、不需要特殊仪器等优点，已被广泛应用于细菌、寄生虫和一些流行病毒的临床诊断中［26］。然而，2015年Hao Peng等研究发现，LAMP检测ALV的阳性率比病毒分离法和PCR法检测出的阳性率更高，具有一定的假阳性［27］。基于在操作与生产成本上的优势，今后LAMP法检测ALV在鸡场具有很大的应用潜力。

2.8 病毒中和试验

病毒中和试验（Virus Neutralization Test，NT）是通过ALV与其相应的抗体发生中和反应，准确检测出ALV的亚型，是血清学检测的范畴［28］。该方法的优点是可以大批量检测样品，且灵敏性高、特异性好，是检测ALV的经典方法。然而，该检测方法需要消耗大量样品，且耗时长、操作烦琐，操作难以实现规范化，临床上应用较少。

2.9 胶体金试纸条检测

胶体金试纸条是生产上常用的快速检测方法之一。该方法以胶体金为免疫标记物，将特异的抗体固定于酸类纤维素膜的一个区域，浸入的样品沿着膜移动至区域时，与抗体发生特异性结合，产生肉眼可见的条带，拥有快速、简便、灵敏等特点，在多种病原菌与流行病毒甚至寄生虫病的检测中已得到广泛的应用。研究人员为了探讨胶体金法在ALV检测中的优势，将国内研发的2款ALV抗原胶体金检测试纸条与3款商品化的ALV-p27抗原ELISA检测试剂盒进行比较，结果表明，胶体金法虽然不与MDV、AIV等禽类病毒产生交叉反应，但在灵敏度上不如ELISA检测试剂盒，仅能检测出80 TCID50/mL的ALV-A、ALV-B、ALV-J、ALV-K和6.25 ng/mL的p27抗原，样品病毒含量较低时易判断为阴性，造成漏检［29-31］，影响净化工作。胶体金试纸条由于操作简便、生产成本较低，适合鸡场大规模的检测，如果能进一步提高胶体金的灵敏性，将有助于该检测方法的推广。

3 结语

虽然关于ALV结构、流行病学特征、致病机理等研究越来越多，但是依然有很多问题亟待解决，如ALV基因的遗传变异规律、快速灵敏准确的临床诊断方法的开发等。因此，为了有效防控甚至彻底消灭ALV，需要大家投入更多的精力，对ALV进行更加深入的研究。