糖尿病血管并发症微小RNA研究进展

范泽楠，贺朝晖综述，方 丹,3审校

（西南医科大学：1临床医学系2015级；2药物研究中心；3心血管药理系，四川泸州 646000）

糖尿病主要包括1型糖尿病（T1DM）、2型糖尿病（T2DM）、妊娠期糖尿病及其他特殊类型。其中，尤以1型和2型DM对人体血管系统产生的影响较大，从而导致严重微血管并发症，例如糖尿病视网膜病变(影响着1/3糖尿病患者)、肾脏相关疾病(糖尿病患者终末期肾病的患病率较非糖尿病患者高出10倍)和神经病变(全球每30 s有1个糖尿病患者因此截肢)；以及导致糖尿病大血管并发症如冠状动脉疾病、动脉粥样硬化、高血压和中风等[1-3]。此外，糖尿病肾病等微血管并发症与心血管疾病的加速发展有着密切的关系。最新研究数据揭示，2017年用于糖尿病的医疗总支出达7270亿美元，全球已有4.25亿糖尿病患者；目前，中国有1.14亿糖尿病患者，位列全球首位，该数目在2045年预计会增至1.19亿[1]。我国的糖尿病现状严峻至此，可见其防治至关重要。

研究表明，糖尿病患者血管并发症发病率的增加与多种病理因素（如高血糖、高脂血症、晚期糖基化终末产物、生长因子、炎性细胞因子和趋化因子等）关系密切[4-5]。如果大多数糖尿病患者的血管并发症不能尽早被给予治疗，其生活质量的提高将无从谈起，甚至其生命也会受到相当威胁。此外，“代谢记忆”现象也逐渐引起临床研究关注，即在治疗过程中，部分糖尿病患者尽管血糖得到了有效控制，但血管并发症的发展却仍在继续[6]。因此，为了寻求更佳的治疗方法，更深入探寻在糖尿病病理状况下血管并发症加速发展的分子调控机制及作用机理的重要性不必赘述。本文对糖尿病微血管并发症病理过程中的miRNA研究进展作出综述，揭示其在基因表达调控网络及对靶基因的精细调控机制中扮演的角色，展望其作为糖尿病微血管并发症的临床诊断和治疗新靶点的广阔临床研究前景。

1 微小RNA简介

微小RNAs(micro RNAs,miRNAs)是由约20～22个核苷酸组成的内源性非编码RNA，在生物体内参与调节着众多关键的细胞生物学功能，扮演着重要角色[7]。20世纪90年代初，研究者首次在秀丽隐杆线虫中发现了第一个miRNA，命名为miRNA-Lin-4[8]。据估计[9]，目前已经发现的人类miRNA超过1000种，它们参与调控了约60%的人类蛋白编码基因，影响靶蛋白功能。miRNA的生物学合成主要涉及在RNA聚合酶Ⅱ的作用下，细胞核基因组中miRNA基因转录合成初级RNA（pri-miRNA），在Drosha-DGCR8复合体的切割效应下，初级miRNA在核内形成约70 nt且具备茎环构造的前体miRNA，随即在RanGTP/Exprotin-5复合物的介导下由核入胞，被Dicer酶切割为双链miRNA（miRNA★复合体）后又在RNA解旋酶的作用下分离，在AGO蛋白和RNA解旋酶的帮助下，成熟的miRNA单链以不对称的方式组装成RNA诱导的缄默复合物（RISC）中，并通过与目标基因的3'-UTR区碱基互补配对来引导RISC复合物抑制目标mRNA翻译，动物miRNA与目的mRNA碱基配对水平相对较低，其中多数是为了抑制翻译[10-12]。

研究表明，在许多疾病生理、病理调节过程中都有miRNA的身影，一些miRNA在糖尿病及血管相关并发症发生发展过程中扮演着重要调控角色，然而其具体分子调控机制远未研究清楚。因此，明确miRNA与糖尿病血管并发症相关靶标的作用及分子机制显得尤其必要，这将为确定新型糖尿病血管并发症生物标志物及治疗靶点提供一定的理论基础及实践依据[13-14]。

2miRNA与糖尿病血管并发症

2.1 糖尿病性视网膜病变miRNA研究进展

糖尿病视网膜病变（DR），糖尿病常见微血管并发症之一，是患者致盲的可能原因[15]。部分研究已经揭示了miRNA在糖尿病视网膜病变过程中所发挥的重要调节作用。例如，Ye等[16]报道，miR-1273g-3p在链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病大鼠的视网膜色素上皮细胞（RPE）中高度表达，推测其是通过调控自噬溶酶体通路参与DR的进展，该研究初步揭示了DR治疗的新靶点。Zhao等[17]研究发现，在高糖（HG）处理的人RPE细胞中，miR-219-5p水平显著上调，并且肝脏受体同源物1(LRH-1)是其直接靶标，HG处理后，靶标LRH-1表达呈显著下调趋势，进一步研究揭示miR-219-5p抑制剂可显著抑制HG诱导的ARPE-19细胞凋亡，提高细胞存活率，并且LRH-1/Wnt/β-Catenin信号通路受到miR-219-5p抑制作用，但LRH 1抑制可消除miR-219-5p抑制剂对ARPE-19细胞的影响，综合提示miR-219-5p能够通过调节LRH-1/Wnt/β-Catenin信号通路进而调控人RPE细胞凋亡，参与DR的发生发展。Zhang等[18]研究发现miR-495在HG处理的视网膜神经节细胞（RGCs）中表达显著上调，抑制miR-495表达可减少RGCs的凋亡。值得注意的是，miR-495对Notch1表达和Notch信号通路存在负性调控，而miR-495表达下调将可进一步抑制PTEN表达，促进Akt活化，敲除Notch1基因后，下调miR-495带来的保护作用被抑制。故而研究者认为，下调miR-495可以通过靶向Notch1调控PTEN/Akt信号，从而减轻HG诱导的RGCs凋亡，这为理解HG诱导的RGCs凋亡的发病机制提供了新的见解。

2.2 糖尿病肾病miRNA研究进展

研究表明，miRNA可作为糖尿病肾病(DN)的治疗标志物及治疗标靶，肾小球系膜区和足细胞等处细胞外基质(ECM)蛋白的堆积是DN的主要特征[19]。Chen等[20]研究发现，DN患者血清和肾组织、STZ诱导的DN大鼠肾组织和HG处理的足细胞中.miR-21表达上调，miR-21缺失可抑制STZ诱导的DN大鼠促炎因子（IL-1β、TNF-α）分泌，减轻肾脏损伤。TIMP3过表达可抑制HG诱导的炎症反应和足细胞凋亡。此外，TIMP3的上述抑制作用随着miR-21的增加而减轻。miR-21通过靶向TIMP3抑制STZ诱导的DN大鼠和HG处理的足细胞的DN进程，这可能提供了DN治疗新的靶点。Zanchi等[21]研究发现，DN大鼠模型中miR-184水平相较于对照组显著升高，而脂质磷酸酶3（LPP3）水平下降。其抑制剂可明显改善大鼠肾小管间质纤维化及LPP3水平，认为miR-184可能通过LPP3作为下游效应因子，促进肾小管间质纤维化。Gholaminejad等[22]通过meta分析得出5个与DN显著相关且持续失调的miRNA，其中包括三种上调miRNA(miR-21-5p，miR-146a-5p,miR-10a-5p)和两种下调miRNA(miR-25-3p和miR-26a-5p)，未来的研究应集中于发现它们对DN的潜在作用及其作为DN生物标志物和治疗介质的临床价值。近期，Jia等[23]研究认为，含有miRNA的细胞外囊泡(EVs)是一种新型的细胞通讯方式，可能与DN期间肾脏纤维化不可避免的扩大有关，肠促胰岛素类似物（Exendin-4）抑制EV miR-192从HG诱导的肾小管上皮细胞向正常细胞的转移，从而抑制胰升糖素样肽-1受体基因（GLP1R）下调，保护肾细胞。

2.3 糖尿病下肢缺血miRNA研究进展

肢体缺血和血管内皮功能障碍是糖尿病的另一个并发症。Caporali等[24]发现在HG培养和缺血相关细胞饥饿条件下，内皮细胞中miR-503表达水平上调。阻断miR-503，内皮细胞的体外功能可以得到提高。他们验证了CCNE1和cdc25a是miR-503的直接目标，在HG的作用下，miR-503的水平有一定下调。在STZ糖尿病小鼠的缺血肢体肌肉中，其表达水平也有所上调。此外，将一种基于miR-503诱饵的腺病毒递送到糖尿病小鼠的缺血肌肉中，可以纠正这些小鼠缺血后血管生成的损伤。值得注意的是，在人类糖尿病患者获得的肌肉样本中，miR-503水平的水平与cdc25蛋白水平呈负相关，这提示miR-503可能是糖尿病并发肢体严重缺血患者的潜在希望。糖尿病周围动脉疾病(PAD)患者缺血后新生血管受损，Chen等[25]研究发现，在培养的糖尿病小鼠内皮细胞中，miR-133a的拮抗作用导致活性氧水平降低，一氧化氮和cGMP水平升高，新生血管增多，而miR-133a过表达会损害血管生成，降低非糖尿病模型的GCH1、NO和cGMP水平，认为糖尿病诱导的miR-133a上调是通过减少内皮细胞NO合成而抑制PAD中的血管新生。

2.4 糖尿病性心脏病miRNA研究进展

研究表明[26]，导致血管细胞多种炎症及纤维化途径的异常信号多由高血糖激活，而这将导致心血管并发症（包括冠心病、中风、高血压和动脉粥样硬化）的增加。此外，糖尿病性心肌病作为糖尿病的并发症之一，与心力衰竭关系密切。

Fomison等[27]对从糖尿病心脏分离的高糖和心脏祖细胞(CPCs)培养的成人心肌细胞的分析证实，促凋亡caspase-3/7活性显著增加可能与miR-34a显著上调和SIRT1下调有关。虽然治疗性抑制miR-34a活性可以恢复心肌细胞和CPCs中SIRT1的表达，但p53表达在心肌细胞中进一步上调，而在CPCs中则相反下调。miR-34a抑制在p53增加的情况下仍能显著降低高糖诱导的心肌细胞凋亡，但这种效应在CPCs中没有被观察到，其可能与miR-34a受到抑制后CPCs的增殖减少有关。因抑制miR-34a活性的作用随细胞类型不同而不同，故在引入其治疗时需要消除非靶向效应。AMP脱氨酶(AMPD)在腺嘌呤核苷酸代谢中起着至关重要的作用,Tatekoshi等[28]研究发现，在2型糖尿病OLETF模型大鼠心脏压力超载条件下，ATP消耗和收缩功能障碍与AMPD活性上调有关，OLETF和LETO心肌中AMPD3的mRNA水平相似、泛素化程度相当，与LETO相比，OLETF中57个miRNA下调，其中miR-301b与AMPD3 mRNA的3'UTR相互作用。在H9c2细胞中，miR-301b抑制剂及模拟物能分别显著提高和降低AMPD3蛋白水平，miR-301b-AMPD3轴可能是干预糖尿病心脏内能量代谢的一种新的治疗靶点。

3 糖尿病血管并发症miRNA与遗传学及表观遗传学之间的关联

DN等并发症似与遗传易感性有关，包括特定临床队列中的全基因组相关研究(GWAS)在内的许多尝试已经促成了一些候选基因和序列变异的识别[29]。然而，此类基因和变异体的功能及病理作用的界定还尚未明确，因此遗传易感性的具体参与似乎更复杂而或更小。研究[30]表明，表观遗传学对此也十分重要，因此，具有表观作用机制的miRNA也应被考虑进来。值得一提的是，包括miRNA、表观遗传学和遗传学在内的多种因素之间可能存在新的相互作用机制。正如前述，染色质中具有表观遗传功能的基因可能是直接靶向和下调的miRNA，染色质的重塑和基因表达可能受到影响。在糖尿病小鼠的VSMC中，miR-125 b相对于对照组上调，并且也有可能靶向染色质组蛋白h3k9甲基转移酶suv39h1，增加糖尿病细胞炎症基因的表达[31]。Sun等[32]报道，在T2DM患者血浆中，miR-375存在过表达，且其启动子低甲基化，这可能参与miR-375的表达调控，并参与T2DM的发病机制。因此，通过下调关键细胞抑制因子，miRNA可以作为促进染色质的表观遗传去抑制机制，导致与糖尿病并发症的病理相关的基因的诱导。

尽管有报告称有一些单核苷酸多态性(SNPs)与各种疾病的相关，但它们很少与疾病发病率直接相关。此外，迄今为止，大多数遗传研究已经评估了基因编码区的SNPs。另一方面，Ning等[33]研究表明，SNPs可能在非编码区域发挥重要作用，包括在启动子、增强子和miRNA种子区域。由于miRNA可以通过目标基因的3'非翻译区来影响基因表达，如果在miRNA处理位点周围或成熟的miRNA种子序列存在任何序列变异，miRNA的生物合成及其功能和目标基因将会发生巨大变化，它可能会通过改变组织和细胞基因表达谱从而影响疾病的易感性。因此，miRNA种子序列的SNPs和变异值得被关注，因为它可能给我们带来更多的惊喜。

除了遗传易感性之外，其他因素，特别是环境和表观遗传学，可能提供“染色质二次打击”，存在将有关于疾病的SNPs转化为导致疾病SNPs的功能。Miao等[34]的研究中，将1型糖尿病患者的血液单核细胞的组蛋白修饰情况与正常志愿者做出一定的比较，发现两个MHC位点基因dr B1和dq B1的增强子区域的组蛋白乙酰化水平存在显著差异，这与1型糖尿病高度相关。Sapienza等[35]研究比较了糖尿病患者和非糖尿病肾病患者唾液样本中的DNA甲基化。一些差异甲基化候选基因曾被报道过与肾脏疾病相关。目前正在进行一些努力，以评估存档的基因组DNA中的表观遗传变化(如DNA甲基化)，以及各种并发症的糖尿病患者的大型临床组群的组织和血液细胞RNA中的miRNA分布情况。大多数情况下，因这些患者的遗传数据已能被获得，故而在整个测序过程、实验证明以及由先进的基因组学、转录组学、外遗传基因组学和计算方法辅助的电子/系统生物学方法的数据集上的数据集的整合，无疑将会产生重要的新信息。这些新的方法将极大提高对未知领域的探索，加速发现临床急需的治疗糖尿病并发症的新疗法。

4 miRNA作为糖尿病血管并发症新型生物标记物

近年来，细胞、组织和体液中的miRNA检测技术得到了一定发展，包括敏感的定量PCR、微阵列以及高通量的深度测序。因此，开发miRNA作为人类疾病和组织损伤的敏感生物标志物潜力巨大。由于miRNA是相对稳定和容易量化的，并且是以血浆和尿液的非侵入方式，这可能满足了对糖尿病并发症的早期检测的生物标记的关键需求，能够可以极大地促进长期的临床管理。报道[36-38]表明，血液中循环的miRNA可以是癌症、组织损伤等敏感的生物标志物。Fomison等[27]研究发现，相较于非糖尿病对照组，miR-34a水平在无症状2型糖尿病患者早期循环中显著升高，且其同时在2型糖尿病患者心脏中显著上调，这极有可能与心肌细胞的凋亡相关，从而作为糖尿病心脏病的基础，故而miR-34a作为糖尿病心脏病的早期诊断的价值值得探索。Alkafaji等[39]报道，在微白蛋白尿和大白蛋白尿的DN患者中，血液miR-377水平与患者肾功能呈负相关，而与白蛋白尿的严重程度存在一定的正相关，而血液miR-192水平与白蛋白尿严重程度呈负相关，与肾功能呈正相关，基于血液的miR-377和miR-192可能作为早期检测DN的潜在生物标志物。DN患者尿液中miRNA谱也发生改变[40]。Mazzeo等[41]通过研究发现，miR-150-5p、miR-21-3p和 miR-30b-5p可能是糖尿病视网膜病变发病的潜在生物标志物。

这些miRNA作为检测相关糖尿病并发症的早期阶段的生物标志物的价值不可限量。与肾、血管和血细胞相关的miRNA可以在血清和尿液样本中被检测，这得益于各种运输机制。当然，应当注意到循环miRNA并不总是与组织水平相关。然而，体液中循环miRNA的评价作为糖尿病并发症的诊断生物标志物的未来仍然可期。

5 展 望

预防或延缓并发症的进展是糖尿病临床管理的主要目标，miRNA靶向与常规药物结合治疗可能是当前临床诊治的一个新途径。miRNA整个信号通路因为其复杂但精密的调节机制而在多种病理过程中都有希望成为很有效的治疗药物(miRNA类似物)或治疗靶点(antimiRs)。同时，RNA分子输送技术的日益提升使得基于miRNA的疾病治疗方案的现实性也随之攀升。

近年来，RNAi基因治疗技术日新月异，这使临床有可能使用RNA分子递送特定的miRNA基因药物来治疗糖尿病及其血管并发症，深入了解糖尿病血管并发症病理过程分子机制可以为相关miRNA药物研发打下基础。此外，miRNA相关药物的研发也离不开对糖尿病患者样本深入且系统的分析，并通过体内和体外模型阐明了目标miRNA与糖尿病血管并发症之间的生物学关系和发病机制。目前，可供检索的公共数据库繁多，可以查询不同糖尿病患者正常组织与血管病变组织的基因组学及蛋白质组学的相关数据。通过数据库分析与分子实验验证相结合，可以鉴定出一些临床上有希望的miRNA候选。下一个主要挑战包括对体内使用的miRNA类似物及抗miRS进行化学修饰以增加其稳定性，以及药物递送系统的选择和优化。

2018年8月，美国食品和药物管理局批准了首款用于治疗成人遗传性转甲状腺素蛋白淀粉变性的小干扰RNA药物。Alnylam公司的产品patisiran（商品名Onpattro）RNA获FDA批准上市，这成为小干扰RNA药物发展的里程碑，它标志着RNA干扰技术在临床治疗中的验证。本研究相信，小核酸药物黄金时代已经到来，有关专家预测，2025年全球市场规模将远远超过100亿美元。近年来，RNAi药物的研发遭遇瓶颈，副作用便是其最大的障碍。然而，随着目前RNAi技术的进步、药物递送系统的突破、新产品的获批，RNAi药物将最终迎来曙光。

6 结论

RNAi药物将在未来迎来快速发展，这将是一个迅猛前进的领域。目前，一些miRNA基因药物的临床试验获得迅猛发展，这从另一个方向揭示了靶向miRNA的治疗是未来的希望。随着更多地了解miRNA在体外和体内精细具体负责的分子调控机制，研究将能够更好地利用它们作为非侵入性生物标记物，乃至研发更好的基于miRNA基因治疗糖尿病及其血管并发症的体内递送方法。