氨基酸分析仪法批量测定小鼠皮质和海马中氨基酸类神经递质和牛磺酸的含量

武春阳 马佳呈 张 楠 张丹参 张 力

1.河北北方学院药学系，河北省神经药理学重点实验室，张家口，075000，中国

2.河北科技大学，石家庄，050000，中国

氨基酸类神经递质是脑内重要的一类神经递质，人脑的功能取决于兴奋性神经递质和抑制性神经递质之间的平衡［1］。谷氨酸（glutamic acid，Glu）和天冬氨酸（aspartic acid，Asp）等为脑内兴奋性氨基酸类神经递质；甘氨酸（glycine，Gly）和γ-氨基丁酸（gammaaminobutyric acid，GABA）等为脑内抑制性氨基酸类神经递质［2］。牛磺酸（taurine，Tau）虽不是神经递质，但其在大脑中广泛分布，具有神经保护作用［3］。

当前氨基酸的检测方法主要有高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）［4］和氨基酸分析仪法（amino acid analyzer，AAA）［5］，其中，AAA 的分析原理基于柱后衍生，衍生化反应在氨基酸和其他物质分离后发生从而避免了干扰，尤其适合于批量样品的分析［6］。本实验选用A300 全自动氨基酸分析仪，旨在建立一种稳定可靠的检测方法，能够对雌雄小鼠皮质和海马内Glu，Asp，Gly，GABA 和 Tau 的含量进行批量检测。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

8周龄SPF 级KM 小鼠，购于北京斯贝福生物技术有限公司，动物生产证许可号：SCXK（京）2016-0002。SPF 级灭菌饲料喂养，于河北北方学院药学系SPF 级标准动物屏障实验室饲养，达到实验月龄，动物饲养与实验过程符合国家动物福利法的要求。

1.1.2 药品与试剂

5 种氨基酸（Tau、Asp、Glu、Gly、GABA）单体标准品，购自美国Sigma 公司；游离氨基酸混合标准品，100 nmol·mL-1，购自德国曼默博尔公司；国产锂盐试剂包，包括①茚三酮溶液；②茚三酮活化剂；③自动进样器清洗液；④反应器清洗液；⑤锂盐流动相A～F；⑥样品稀释液，购于德国曼默博尔公司青岛技术服务中心；5-磺基水杨酸（5-sulfosalicylic acid dihydrate），购自天津市永大化学试剂有限公司；高纯氮，99.999%，购自北京市北温气体制造厂。

1.1.3 实验仪器

A300 全自动氨基酸分析仪，德国曼默博尔公司；Sigma 3K30 高速冷冻离心机，德国；FSH-2A 可调高速匀浆机，江苏大地自动化仪器厂；WH-2 微型旋涡混合仪，上海沪西分析仪器厂；ME235P 电子分析天平，德国Sartorius；KQ520DV 数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；UPT-I-60L 优普系列超纯水设备，成都超纯水科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 混合标准样品的配制

分别准确称取5 种氨基酸标准品（Tau，Asp，Glu，Gly，GABA）6.26，6.66，7.36，3.75，5.16 mg，超声均质溶解，使用超纯水定容至100 mL，得到浓度为500 μmol·L-1的混合氨基酸标准溶液，置-20℃冰箱保存备用。

1.2.2 脑组织样品的制备

小鼠生长达到6月龄、7月龄时进行实验。实验前，小鼠禁食不禁水12 h，随机选取相同日龄的雌雄小鼠各3只，称体质量后断头处死，置于冰上分离剥去脑外组织，取全脑置于4℃生理盐水中冲洗，取出滤纸吸干，于冰上分离双侧皮质和海马，称量皮质与海马重量后分别置于冰盒中的10 mL 离心管，根据所取脑组织重量按照一定的比例加入冰冷超纯水（皮质：水=1 g：20 mL，海马均加1 mL）进行匀浆，随后低温离心7 min（4 500 r·min-1），移取400μL上清液，加 入100 μL 10%磺基水杨酸溶液，旋涡仪混合均匀，置于4℃冰箱中冷藏静置60 min 进行蛋白沉淀，之后4℃低温离心15 min（14 500 r·min-1），取400 μL 上清液加入400 μL 样品稀释液，旋涡仪混合均匀，后经针孔过滤器（0.22 μm）过滤后于-20℃冰箱冷冻保存。

1.2.3 显色试剂的活化

在加热条件以及弱酸环境下，氨基酸与茚三酮溶液发生显色反应。茚三酮溶液在使用前需使用活化剂活化（100 mL 茚三酮溶液+40 mg 活化剂），需预先配好并在室温下避光静置4 h 以上。

1.2.4 进样次数

在进行批量氨基酸检测时，进样次数是有上限的，在实验所需的试剂中（包括茚三酮溶液、锂盐流动相A～F、自动进样器清洗液、反应器清洗液），一次进样消耗最多的试剂为茚三酮12 mL，仪器内存放的试剂瓶容量为400 mL，试剂瓶剩余液量过低（＜50 mL）时仪器报警并停止分析，故一次实验最多不应超29次（＜350 mL）。一次进样分析所需时间为145 min，一次实验最长大概需要72 h（包括1 h 清洗程序和1 h 自检程序）。

1.2.5 色谱条件

分离柱：游离氨基酸锂盐柱（Column kit，Lithium system）；流动相：锂盐试剂（A～F，pH 逐渐升高）；衍生试剂（显色剂）：主要成分为茚三酮；缓冲液流速：180 μL·min-1；检测波长：570 nm；分离柱初始温度：40℃，反应器初始温度：70℃，且温度随梯度洗脱程序不断变化；进样量：20 μL；使用仪器谱图处理软件AminoPeak 进行数据采集处理［7］。

1.2.6 稀释系数的计算

在含量测定的过程中，需要计算每个样品的稀释系数。在本实验中，取A g 脑组织，按照“1.2.2”样品制备时的比例加入B mL 水，匀浆离心后，取0.4 mL样品加入0.1 mL 10%磺基水杨酸溶液，经过蛋白沉淀、离心、过膜后，从中取0.4 mL 加入0.4 mL 锂盐试剂包的样品稀释液，最终从旋涡混合均匀后的样品中取20 μL 进样，本实验稀释系数的计算方法为：（1 000/20）×（0.4+0.4）×［（0.4+0.1）/0.4］×（B/0.4）×10-6×100%=B×125×10-4（%）。

1.3 统计学分析

使用SPSS 19.0 中的两独立样本均数t检验对相同日龄雌雄小鼠皮质和海马中的5 种氨基酸含量进行统计学分析，P＜0.05 表示雌雄小鼠之间氨基酸含量的差异有统计学意义。

2 结果

2.1 方法学考察

2.1.1 专属性实验

取稀释后的混合标准溶液（400 μmol·L-1）和按照“1.2.2”项下处理的皮质及海马样品溶液在“1.2.5”色谱条件下进样分析，根据保留时间判定氨基酸的种类。由Fig.1 可知，样品中Tau、Asp、Glu、Gly 和GABA 5 种氨基酸的峰形良好，分离度较高。

2.1.2 线性关系

精密吸取“1.2.1”项下配制的标准溶液，配制成浓度为400，200，100，40，8 μmol·L-1的溶液，在“1.2.5”色谱条件下进样，每个浓度进样3次，得到以Tau，Asp，Glu，Gly 和GABA 五种氨基酸浓度为横坐标，峰面积为纵坐标的回归方程，结果见Tab.1。结果显示，在8～400 μmol·L-1的浓度范围内，5 种氨基酸的线性良好。

Tab.1 Standard curves，linear ranges and coefficients of five amino acids（n=3）

2.1.3 检测限与定量限

以信噪比S/N=3 确定5 种氨基酸的最低检出限，以信噪比S/N=10 确定5 种氨基酸的定量下限，结果见Tab.2。

Tab.2 Detection limit and quantitative limit

Fig.1 Five kinds of amino acids in samples detected by AAA

2.1.4 日内精密度和回收率试验

取100 μmol·L-1的混合标准溶液，在“1.2.5”色谱条件下进行分析，连续进样6次，得到Tau，Asp，Glu，Gly 和GABA 峰面积的RSD；取按照“1.2.2”项下处理的样品溶液在“1.2.5”色谱条件下进样分析，连续进样6次，得到样品中5 种氨基酸峰面积的RSD；取已知含量的样品溶液，加入一定浓度的混合标品溶液，使加标后各氨基酸浓度最大值不超400 μmol·L-1，按“1.2.5”色谱条件测定6次，得到5 种氨基酸的加标回收率。结果表明（Tab.3），仪器日内精密度和准确度良好。

Tab.3-1 Precision of mixed standard samples（±s，n=6）

Tab.3-1 Precision of mixed standard samples（±s，n=6）

Tab.3-2 Precision of brain tissue samples（±s，n=6）

Tab.3-3 Recovery rate of brain tissue samples（±s，n=6）

Tab.3-3 Recovery rate of brain tissue samples（±s，n=6）

2.2 日间精密度测定

在一天内连续进样3次标样，结果取均值，在同一时间连续进样5 d，得到标样中5 种氨基酸峰面积的日间精密度为36.40%～42.74%，可见，仪器的日间精密度偏差大，考虑与茚三酮试剂随时间的推移而不断氧化导致显色效果逐渐降低有关，这与5 d 内氨基酸峰面积数值逐渐降低的结果吻合，进行样品批量分析时需要的时间较长（3～4 d），故实验需要获取更准确的标样峰面积结果来准确计算样品中氨基酸的含量。

2.2.1 添加氮气保护稳定性检测

添加氮气保护在理论上可一定程度避免显色试剂与空气中的氧接触，从而减少氧化，本实验采用99.999%的高纯氮，在保证气密性的前提下对显色试剂提供氮气保护。Tab.4为不同氮气压力下，连续进样6次标准样品时5 种氨基酸的日内精密度。结果表明（Tab.4），添加氮气并不能获得准确的标样峰面积结果，而且进行批量分析样品时，由于分析时间较长，随着氮气的不断消耗，氮气表压可能会出现不稳定的情况，氮气流速过大有损仪器管路结构。因此，本检测方法改为无氮气保护检测。

Tab.4 Intraday precision of amino acids under different nitrogen pressures（n=6）

2.2.2 绘制标样峰面积衰减曲线

本实验采用绘制标样峰面积衰减曲线的办法获取准确的标样峰面积结果来计算样品中氨基酸的含量。在进行批量样品分析的初始、过程中、终末时分别进一次标样（初始时进两次，以第二次为准），绘制标样峰面积的衰减曲线，选择对应的标样峰面积作为校正因子。Fig.2为分别在小鼠6月龄和7月龄制备脑组织样品后立即进行批量分析时5 种氨基酸标样峰面积的衰减曲线。衰减曲线显示，标样峰面积的衰减并不恒定。

2.3 雌雄小鼠皮质和海马内5 种目标氨基酸的含量

在计算不同样品含量时，选择衰减曲线中对应的标样峰面积作为校正因子，得到样品中5 种氨基酸含量，结果如Fig.3 所示。统计学分析表明，相同日龄小鼠脑组织（皮质、海马）内的5 种氨基酸含量在不同性别之间未发现差异有统计学意义（P＞0.05），说明实验方法准确可靠。

3 讨论

氨基酸分析仪法是国内外游离氨基酸定量分析的一种常用方法［8-9］，实验选用德国曼默博尔公司的A300 全自动氨基酸分析仪。

3.1 检测方法的优势

Fig.2 Attenuation curve of amino acid standard peak area when batch testing samples

Fig.3 Amino acid content in cortex and hippocampus samples of male and female mice of the same age（±s，n=3）

可对制备好的氨基酸样品自动进行批量检测，检测过程无需人工干预，只需编辑好分析程序即可。本实验以SPF 级KM 小鼠为研究对象，采用A300 氨基酸自动分析仪，对雌雄小鼠皮质和海马内的Tau，Asp，Glu，Gly 和GABA 含量进行了准确测定，该方法具有良好的专属性、线性关系，日内精密度和回收率符合要求，通过绘制标样峰面积曲线测得的氨基酸含量准确可靠，经过方法学考察，该方法适用于小鼠脑组织中目标氨基酸含量的批量测定。

3.2 注意事项

①需要做好分析前仪器的检查，校正试剂液量以保证正常运行，实验前对仪器进行排气泡、清洗、检测压力的操作尤为重要，否则一旦分析过程中出现问题，仪器自动停止分析，将导致结果不准确、浪费试剂、降低分离柱效能、减少仪器寿命等诸多问题；②其次，在一次实验中应尽量多的分析待测样品以节省标准样品和试剂，这样做可同时减少仪器自检程序的次数从而节省时间；③对于定量分析游离氨基酸样品，柠檬酸锂缓冲体系比柠檬酸钠缓冲系统有明显的优势［10］；④氨基酸样品直接进样分析得到的谱图基线不太稳定，加入一定比例的样品稀释液（主要成分为甲酸、乙酸、乙醇，pH为2.2）后能有所改善，增加实验的准确性；⑤小鼠处死后，应立即制成脑组织游离氨基酸样品再进行冻存，直接冻存固体脑组织而不及时制备氨基酸样品可影响实验结果的准确性。

3.3 检测方法的优化

氨基酸分析仪的定量原理为外标法［11］，获取准确的标样峰面积是实验的重点。该方法试验结果显示，在本研究中传统的添加高纯氮气，并不能保证茚三酮不被氧化，在进行样品批量分析时，由于分析时间长，随着茚三酮的不断消耗，茚三酮的显色效果如何变化及变化多少直接影响着实验结果的准确性，采用绘制标样峰面积曲线的方法能揭示显色效果的趋势，通过曲线方程能得到更加准确的标样峰面积。因此，本研究对检测方法进行了优化，取消了传统的氮气保护，得到更稳定的标样峰面积。