光谱指纹定量法评价木香顺气丸质量

王玲娇 ，孙国祥 ，戴 娜 ，杨继章 ，于 静

（1.河北医科大学第一医院，河北 石家庄 050031； 2.沈阳药科大学药学院，辽宁 沈阳 110016；3.河北省直属机关第二门诊部，河北 石家庄 050000）

木香顺气丸由木香、砂仁、香附（醋制）、槟榔、甘草、陈皮、厚朴（制）、枳壳（炒）、苍术（炒）和青皮（炒）10 味中药组方，传统剂型为水丸，收载于2015年版《中国药典（一部）》[1]。其具有行气导滞、燥湿健脾等功效，常用于治疗食积、腹痛、气郁等症[2]。药典收载的质量标准为用高效液相色谱（HPLC）法测定厚朴酚含量，现有文献报道了厚朴酚的HPLC指纹图谱[3]和甲醇提取物的指纹图谱[4]，也有文献报道橙皮苷、厚朴酚、和厚朴酚、木香烃内酯等单个或多个成分的含量[5-8]。紫外指纹图谱可反映中药中具有不饱和化学键及其共轭体系基本物质的吸收情况，并以此控制中药质量[9-10]。红外指纹图谱不仅可反映中药中多种化合物成分饱和键的吸收，且样品预处理简单，无须行样品损坏检测[11]。可通过适当校正样本建立数学模型，应用优化后的数学模型和未知样品的近红外光谱[12-13]，进行中药质量控制。本研究中利用中药红外-紫外光谱（IR-UV）联用技术[14-15]建立木香顺气丸的光谱指纹图谱，结合光谱指纹定量法宏观定性定量评价木香顺气丸的质量，进而实现其质量控制。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1100型高效液相色谱仪（含DAD检测器、四元低压梯度泵、在线脱气和自动进样装置及Chem-Station工作站，美国Agilent公司）；KDM型控温电热套（山东鄄城华鲁仪器公司）；BS110S型分析天平（北京赛多利斯天平有限公司）；RE-52型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；Bruker IFS55型红外分光光度仪（瑞士布鲁克公司）。

1.2 试药

16批木香顺气丸样品来源见表1。甲醇（色谱纯，山东禹王实业有限公司禹城化工厂），其他试剂均为分析纯，水为去离子水。

表1 木香顺气丸厂家、批号及剂型

2 方法与结果

2.1 分析条件

2.1.1 UV 光谱条件

光谱管：Agilent聚四氟乙烯（PTFE）管（600 mm ×0.17 mm）；柱温：（30.0 ±0.15）℃ ；流动相：甲醇 -水（50 ∶50， V／V）;流速:0.5 mL ／min;进样量:0.1 μL;检测波长:220～450 nm（DAD），数据采集间隔 0.5 nm，狭缝宽度1 nm。

2.1.2 IR 光谱条件

波段：4 000 ～ 400 cm-1；分辨率：8 cm-1；扫描速率：20 次 ／s；升温速率：2 ℃ ／min。

2.2 供试品制备

UV光谱：取样品约6 g，精密称定，加入75%乙醇50 mL回流提取1.5 h，滤过，残渣重复滤过1次，残渣中再加入95%乙醇40 mL回流1 h。合并3次滤液，减压浓缩至约10 mL，然后用95%乙醇定容至25 mL，摇匀，作为供试品溶液。

IR光谱：取样品 2丸，研磨成粉末，取1～2 mg，精密称定，精密称取150 mg干燥的KBr粉末，研磨、混匀，转移至模具中，在低真空下用约10 GPa的压力，经约2 min即可将样品压成透明供试品薄片，精密称定质量，于10 min内测试。

2.3 IR-UV光谱定量法原理

选择一固定对照模式（至少平均生成10批样品，也可选用指纹对照品）作评价标准，分别以IR和UV光谱各数据点为基础，分别按公式(1)(2)(3)计算样品的IR和UV光谱与标准光谱间的宏定性相似度(Sm)、宏定量相似度(Pm)、均化系数相对偏差(α)；对IR和UV指纹图谱反映的两类宏观定性定量信息进行等权融合，计算公式见（4)(5)(6），据此建立中药IR-UV联用指纹系统等权融合模型。中药IR光谱和UV光谱突出反映了两类宏观定性定量信息，IR光谱能检测单键信息，可补偿UV光谱仅能检测不饱和键的不足。这一方法构成了基于中药整体系统化学键振动和价电子跃迁的光谱指纹定量法，反映的整体定性定量信息明显好于任何单一色谱指纹图谱和单一光谱指纹图谱，称为中药IR-UV联用光谱指纹定量法。据此将中药质量划分为8个等级（见表2）。

2.4 指纹图谱的建立和评价

2.4.1 UV 光谱指纹图谱

1)方法学考察

精密度试验：取编号为S1的样品，按2.2项下方法制备供试品溶液1份，按2.1.1项下检测条件连续进样6次，以265 nm波长处木香顺气丸非分离色谱图考察进样精密度。结果其保留时间和峰面积的 RSD均小于0.3%（n＝6），表明方法精密度良好。

表2 中药IR-UV联用系统指纹定量法划分中药质量等级

稳定性试验：取编号为S1的样品，按2.2项下方法制备供试品溶液 1 份，分别于 0，2，4，8，12，24 h 时按2.1.1项下检测条件进样测定，以265 nm波长处木香顺气丸非分离色谱图考察稳定性。结果保留时间和峰面积的 RSD 分别小于 1.0% 和 3.0%（n＝6），表明供试品溶液在24 h内稳定。

重复性试验：取编号为S1的样品，按2.2项下方法制备供试品溶液6份，按2.1.1项下检测条件进样测定，以265 nm波长处木香顺气丸分离色谱图考察重复性，结果保留时间和峰面积的 RSD分别小于1.0%和3.0%（n＝6），表明方法重复性良好。

2)图谱建立

将16批木香顺气丸分别进样检测，记录220～450nm波长处的在线UV光谱，详见图1。考虑到流动相中甲醇和提取溶剂中乙醇的末端吸收，又由于波长在450 nm后制剂成分基本无吸收，因此确定220～450 nm波长用于鉴定其不饱和成分的含量情况。将样品信号导入自主研发的中药光谱指纹图谱超信息特征数字化评价系统3.0软件，以各数据点为计量单元按均值法生成对照指纹图谱，并根据系统指纹定量法计算各样品 Sm-UV，Pm-UV，αUV值。结果见表 3。

3)图谱整体质量评价（系统指纹定量法）

图1 16批木香顺气丸的紫外指纹图谱

由表3可知，质量等级从Ⅰ级到Ⅴ级分布，来自6个厂家的16批样品的质量出现明显差异，S3，S5，S10为Ⅰ级，质量极好；S8和S14为Ⅴ级，质量为中等。所有样品 Sm-UV≥0.993，73.1% ≤ Pm-UV≤127.8% ，0.001≤αUV≤0.057，说明16批样品UV指纹数量和分布比例较相似，但整体含量仍有差异，大部分样品质量等级介于Ⅰ～Ⅲ级，仅S8和S14质量等级为Ⅴ级，究其原因，主要为 Pm-UV值的显著差异，S8 Pm-UV值过高（127.8%），S14 Pm-UV值过低（73.1%），导致这2批次的质量等级为Ⅴ级。除此之外，来自同一生产厂家的药品质量一致性略有差异，个别厂家甚至差异很大，如 S5，S6，S12（山东三九药业有限公司）质量等级相同或相似，分布在Ⅰ级和Ⅱ级；S8，S9，S16（广州中一制药有限公司）样品质量等级分别为Ⅴ级、Ⅲ级和Ⅱ级。

2.4.2 IR 指纹图谱

1)方法学考察

精密度试验：取编号为S1的样品，按2.2项下方法制备供试品1份，按2.1.2项下检测条件连续进样6次，记录光谱图，导入中药光谱指纹图谱超信息特征数字化评价系统 3.0 软件。结果 SIR≥0.990 且 RSD ＝0.23%（n＝6），表明方法精密度良好。

表3 UV、IR及UV-IR鉴定16批木香顺气丸药材质量等级

稳定性试验：取编号为S1的样品，按2.2项下方法制备供试品 1 份，分别于 0，1，2，3，4，6 h 时按 2.1.2 项下检测条件进样测定，记录光谱图，导入同一软件。结果SIR≥0.990且 RSD ＝0.15%（n＝6），表明供试品溶液在6 h内稳定性良好。

重复性试验：取编号为S1的样品，按2.2项下方法平行制备供试品6份，按2.1.2项下检测条件进样测定，记录光谱图，导入同一软件，结果 SIR≥0.990且RSD ＝0.36%（n＝6），表明方法重复性良好。

2)图谱建立

将16批样品分别进行IR光谱检测，记录400～4 000 nm波长处的中药IR光谱，详见图2。将样品信号导入同一软件，以各数据点为计量单元按均值法生成对照指纹图谱，并根据系统指纹定量法计算各样品 Sm-IR，Pm-IR和 αIR值。结果见表3。

图2 16批木香顺气丸红外光谱图

3)图谱整体质量评价（系统指纹定量法）

由表3可知，各个样品之间质量差异很大，质量等级最好为Ⅰ级，最差的达Ⅷ级，S1，S3，S5，S6，S16 为Ⅰ级；S10 和 S13 为Ⅱ级；S9，S14，S15 为Ⅲ级；S4，S8，S11为Ⅳ级；S2和 S7为Ⅴ级；S12为Ⅷ级。所有样品Sm-IR≥0.983，71.6% ≤ Pm-IR≤164.6% ，0.001≤αIR≤0.074，说明16批样品IR指纹数量和分布比例相似，但指纹整体含量存在显著差异。S12因 Pm-IR值过高（164.6%），未达到合格要求；而S2因 Pm-IR值过低（71.6% ），质量评价为中等。

2.4.3 IR-UV联用评价木香顺气丸质量

根据公式(4)(5)(6)对UV指纹图谱和IR指纹图谱分析结果进行整合，用光谱指纹定量法鉴定16批木香顺气丸质量。结果见表3。16批样品 Sm-IRUV≥0.991，表明16批木香顺气丸的化学成分的种类和分布比例十分相似。S3，S5，S6，S8，S9，S10，S15，S16 质量为极好（Ⅰ级），S1 和 S7 质量为很好（Ⅱ级），S2，S4，S11，S13，S14质量为好（Ⅲ级），S12质量为中等（Ⅴ级）。

2.4.4 不同分析方法评价结果比较

由图3可知，16批样品在不同分析方法下的质量等级评定结果不同。如S12在UV光谱指纹图谱、IR光谱指纹图谱和整合法时质量等级分别为Ⅱ级、Ⅷ级和Ⅴ级。采用IR和UV指纹图谱分别计算16批木香顺气丸的 Sm均不低于0.99，2种方法均证明，各批样品化学成分种类和分布比例都十分相似，由于IR和UV光谱检测原理的显著不同，导致宏定量相似度 Pm差异很大。上述不同分析方法的定量相似度见图4。

图3 不同评价方法得到的样品质量等级

图4 不同评价方法得到的样品定量相似度结果

3 讨论

中成药化学成分非常复杂，单一地采用UV或近IR分析技术分析时，并不能真实全面地反映中药的质量。本研究中以IR检测单键信息，以弥补UV仅能检测不饱和键的不足，实现了IR-UV联用对木香顺气丸进行整体定性和整体定量的快速鉴定，基于光谱学的简单、快捷并在多组分未分离的情况下得到整体的数据来区别中成药的质量等级，试图全方位、多角度揭示中药复杂的特征，为其质量控制提供新思路。由于中药信息的量大及不确定性可能会使制剂的质量等级在不同分析方法中发生较大差异，多种分析方法的联合或许能进一步缩小误差，从而使试验结果更接近中药的真实质量。但光谱指纹图谱不能揭示药物确定的有效成分，也不能解释生物活性成分和质量等级的相关性，因此结合中药的药效学构建更全面的定性定量光谱指纹学的质控模型得进一步研究。