HPLC法测定保健食品中叶酸含量及稳定性研究

(浙江省医学科学院，杭州 310013)

叶酸是一种重要的维生素，参与人体的许多生理活动，是维生素B复合体之一，最初从菠菜叶中提取纯化，故命名为叶酸。叶酸为机体细胞生长和繁殖所必需的物质，与维生素B12一起促进了红细胞的生成和成熟，是机体制造血红细胞不可缺少的物质[1，2]，还参与帮助蛋白质代谢。叶酸的缺乏可以导致生理功能低下及某些疾病，如巨幼红细胞贫血、智力退化、新生儿神经管畸形，白细胞减少症等；叶酸对孕妇非常重要，孕妇补充足够的叶酸，可防止新生儿婴儿腭裂、体重过轻、早产症状。有研究表明在3岁以下的婴儿食品中添加适量的叶酸，能对婴幼儿神经与脑细胞发育有着很好的促进作用。叶酸的新作用被国内外一些学者慢慢发掘：治疗慢性萎缩性胃炎、防止心肌劳伤及心肌梗塞、抗肿瘤等，使得叶酸成为维生素C、维生素E之后新崛起的一种保健维生素产品，其市场前景十分广阔[3]。目前，叶酸的测定方法有主要有：微生物法[4]和色谱分析法[5-7]等，其中微生物法是经典方法，是国家标准方法，以其经典、准确可靠性为许多国际标准方法机构作为标准方法或第一法；但操作繁琐，易受广泛使用的抗生素影响，且是半定量法；色谱法实现了叶酸不同成分的分离，特异性高，已报道的高效液相色谱法检测器分荧光和紫外2种[8-10]，荧光检测器检测灵敏度高, 但是需要衍生化处理, 过程繁琐复杂[11-13]。中国药典2015年版叶酸的测定采用的是高效液相紫外检测器法[14]，处理较简单，本实验采用了中国药典2015年版的方法对保健食品中叶酸进行检测并对及其稳定性进行了研究。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

高效液相色谱仪(美国安捷伦)Agilent 1220 Infinity ；数显恒温水浴锅(国华电器有限公司) HH-4；叶酸标准品(纯度：97%)；氨水(分析纯)；甲醇(色谱纯)；乙腈(色谱纯)；供试品由浙江华方生命科技有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件

色谱柱：ZORBAX SB-C18(150mm×4.6mm，5μm)；流动相：磷酸盐缓冲液∶甲醇=70∶30；检测波长：280 nm;仪器流速：1.0 mL/min；仪器柱温：30 ℃；进样体积：5 μL。

1.2.2 标准溶液的制备

准确称取24.15mg 叶酸(纯度为97.0%)于25 mL棕色量瓶中，用0.5%氨水溶解并定容至刻度，摇匀即得0.9370 mg/mL浓度的叶酸对照品溶液。

1.2.3 样品处理

准确称取样品1.0080 g置50 mL容量瓶中，加15 mL0.5%氨水75℃热水浴20 min，时时振摇，冷却，用水定容至刻度，摇匀后离心。用0.45 μm 微孔滤膜过滤，作为试液。

1.2.4 产品稳定性样品处理

将样品放在湿度为75%±5%，温度为37 ℃左右的恒温恒湿培养箱中分别放置1个月、2个月、3个月后，进行加速试验后按1.2.3样品处理后测定。

2 结果与讨论

2.1 叶酸的HPLC色谱图

分别取叶酸对照品、供试品各5 μL于高效液相色谱仪中测定，再根据叶酸的保留时间进行定性试验，和外标法的峰面积进行定量试验。结果叶酸对照品和供试品分别如图1和图2所示。

图1 叶酸标准品色谱图

图2 样品色谱图

2.2 标准曲线

准确吸取已配置好的叶酸标准溶液50 μL置于10mL棕色量瓶中，用水定容至刻度，摇匀即得4.685 μg/ mL 叶酸溶液浓度。然后分别准确吸取叶酸标准溶液50 μL、100 μL、200 μL、400 μL置于5 mL棕色量瓶中，和上述一样处理最后得到系列浓度分别为4.685 μg/mL、9.370 μg/mL、18.740 μg/mL、37.480 μg/mL、74.960 μg/mL 的叶酸标准系列溶液。通过仪器设定好的条件自动进样5 μL，测定出的峰面积以(Y)表示，溶液浓度以(X)表示，再进行线性回归，计算出回归方程为：Y=18.317X，r=1。结果表明：叶酸在4.685 μg/mL～74.960μg/mL内线性关系良好。

2.3 精密度

准确吸取标准系列下中间浓度值为18.74 μg/mL的对照品溶液5 μL，按照1.2.1项下色谱条件连续进样9次，按峰面积计算叶酸的相对标准偏差(RSD)为0.53%(n=9)。

2. 4 重现性试验

取同一批号样品，按1.2.3项下方法制备6份样品溶液，按照1.2.1色谱条件测定，得叶酸含量的RSD为2.2%(n=6)，表明方法的重现性良好。

2. 5 加标回收率

准确称定9份样品各1.0g左右，分别加入已知浓度的叶酸标准溶液，制备成相当于标示量的50%、80%、100%的模拟样品，按1.2.3制备样品并测定含量，计算样品的加标回收率为94.8%～97.6%,平均回收率为96.0%，RSD为1.1%(表1)。

表1 加标回收率试验结果

2.6 检出限及定量限

以3倍信噪比(S/N) 计算得叶酸的检出限为0.18 μg/mL。 以10倍信噪比(S/N) 计算得叶酸的定量限为0.60 μg/mL。

2.7 样品加速破坏性试验稳定性

在75%湿度、37℃的温度条件下对保健食品进行了3个月加速破坏性试验[15]，是对其在保质期内有效成分的稳定性进行考察，因此试验将样品放置恒温恒湿0个月(放置前)、1个月、2个月、3个月后分别对3批加速试验产品的样品中叶酸含量进行了分析，结果表明样品中叶酸含量平均下降比率为2.6%，说明样品中叶酸的稳定性良好。

3 结论

利用HPLC法检测保健品中的叶酸，该方法下叶酸在4.685 μg/mL～74.960μg/mL内线性关系良好，精密度良好即相对标准偏差(RSD)为0.53%(n=9)，重现性实验叶酸含量的RSD为2.2%(n=6)，表明方法的重现性良好准确，可用于保健食品中叶酸质量控制，同时保健食品中的叶酸经过3个月加速试验，样品中叶酸含量平均下降比率为2.6%，结果表明含量变化不大，稳定性良好。