EMS诱变对赶黄草产量与品质的影响

叶 霄，侯 睿，李 钰，孙 佩，童 文，黄位年，尹存平，杨 晓

(四川省农业科学院 经济作物育种栽培研究所，四川 成都 610300)

赶黄草又名扯根菜，是虎耳草科(Saxifragaceae)扯根菜属(Penthorum)植物扯根菜(PenthorumchinensePursh.)的干燥地上部分。为传统苗药，甘、温，利水除湿、祛痰止痛，用于黄疸、水肿和跌打损伤等症[1]，具有抗氧化、保肝、健脾、退黄等功效，为中成药“肝苏颗粒”、“肝苏胶囊”的原料药材，也可用于赶黄草茶等新资源食品；是四川古蔺道地药材；收录于《中药大辞典》[2]和《四川中药志》[3]，目前《中国药典》尚未记载。赶黄草中主要成分为黄酮化合物、有机酸、挥发油等[4-6]，以总黄酮或槲皮素为目标提取物进行提取工艺的研究较多[7-8]。目前其相关产品在国内的销售逐年上升，成为热门地方药材之一。国内主要分布于华北、华东及云贵川等地。全世界仅中国原产的可作药用。

化学诱变育种法是用不同化学诱变剂处理植物材料，从而引起形态特征的变异，然后根据育种目标进行鉴定和培育的方法，具有操作简单、经济方便、突变频率高、突变范围广等特点，是目前新材料创制的重要手段[9-11]。其中甲基磺酸乙酯(EMS)是一种常见的烷化诱变剂，突变频率高，能产生范围较广的突变类型如转换、颠换等，目前广泛应用于各种作物的诱变育种[12-15]。赶黄草育种相关研究较少，育种方法单一，基本以系统选育为主要育种方法，化学诱变育种法在赶黄草育种上的应用鲜见报道。因此，以四川省古蔺县赶黄草地方品种为基础材料，采用系统选育法育成的新品种赶黄草1号[16]为原材料，使用EMS对其种子进行诱变处理，探求EMS对赶黄草产量及品质的影响，以期为后续创制赶黄草优质突变体材料奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试的赶黄草材料为赶黄草1号，来源于四川省农业科学院经济作物育种栽培研究所；诱变剂为甲基磺酸乙酯(EMS)，由美国Sigma公司生产。

1.2 试验时间及地点

EMS化学诱变处理于2016年12月在成都中医药大学实验室进行，2017年1月在四川省农业科学院经济作物育种栽培研究所进行发芽及田间试验，10月进行品质测定。

1.3 试验方法

1.3.1 试剂配置 溶质为EMS诱变剂，溶剂是pH 6.5的0.01 mol/L磷酸盐缓冲溶液(Na2HPO4·12H2O-Na2HPO4·H2O)，分别配置为6种浓度EMS溶液：0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%和1.1%。

1.3.2 EMS诱变试验 称取赶黄草1号种子各0.5 g，分别加到装有500 μL上述不同EMS浓度的EP管中，放置于26℃、110 r/m的摇床内，分别诱变处理5 h、10 h和15 h。诱变处理后，用pH 6.5的0.01 mol/L磷酸盐缓冲溶液润洗，每隔0.5 h换1次磷酸盐缓冲溶液，冲洗3 h后用自来水冲洗2 h。设置清水对照，3次重复，共63个处理。

1.3.3 发芽率试验 在试验田内取一定量土壤，过0.5 mm铁筛，放入烘箱以105℃烘干8 h备用。称取土壤15 g放入直径8 cm的培养皿，整理平整，记录重量，放入干燥箱烘3 h，直到恒重。将加入赶黄草种子的培养皿放入恒温培养箱，每天称量培养皿重量，水分挥发后加水保持恒重。萌发条件：温度15℃，土壤水分55%，光照强度100%。3次重复，记录发芽数目(发芽标准为胚根长度等于种子长度)。

1.3.4 田间试验 将处理好的赶黄草种子在试验田进行育苗移栽，按小区种植。试验采用完全随机区组设计，3次重复。小区内赶黄草种植10行，每行20株，共计200株。小区面积6.0 m2(4.0 m×1.5 m)。小区周围设保护行。按照赶黄草种植标准进行田间管理，对整齐度、株高、株直径、分枝数等进行详细调查。果期收获后对小区总鲜重和叶鲜重进行测量，并计算叶比重。

1.3.5 总黄酮含量测定 将收获后的赶黄草进行取样分析，参考《中华人民共和国药典》(2015年版)山楂叶项下总黄酮含量测定[17]，采用紫外分光光度法测定总黄酮含量：在420 nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标、浓度为横坐标。

1.3.6 槲皮素含量测定 按照《四川省中药材标准》(2010年版)规定的高效液相色谱法[3]测定样品中槲皮素含量。

1.3.7 统计分析 采用SPSS 22.0软件对试验数据进行方差分析、Duncan多重比较及Duncan单因素统计分析。

2 结果与分析

2.1 EMS诱变后赶黄草的发芽率

从表1和图1看出，所有处理的赶黄草种子发芽率均低于对照，且随EMS浓度上升，发芽率总体呈下降趋势，下降幅度为30%～85%，表明EMS对赶黄草种子出苗具有抑制作用。赶黄草种子受EMS浓度、浸种时间的综合影响，发芽率表现不同变化趋势。以对照平均发芽率的1/2(即42%)为半致死剂量判断标准，所有处理中发芽率低于42%的占50.00%，低于20%的占27.78%，最低发芽率仅为13%。综合考虑，EMS浓度为0.5%的赶黄草种子发芽率为40%～60%，处理随时间的变化相对稳定，因此认为，EMS浓度0.5%是赶黄草种子诱变的较宜浓度。

经方差分析和多重比较结果，FEMS浓度=11.6370>F0.05，F反应时间=2.5740

表1 EMS诱变后赶黄草的发芽率Table 1 Germination rate of P.chinense treated with EMS %

注：同列不同大、小写字母分别表示差异达极显著水平(P≤0.01)和显著水平(P≤0.05),下同。
Note: Different capital and lowercase letters in the same column indicate significant difference atP<0.05 andP<0.01 level respectively.The same below.

图1 EMS诱变后赶黄草的发芽率变化趋势Fig.1 Variation trend in germination rate of P.chinense treated with EMS

2.2 EMS诱变后赶黄草的株高及株直径

从表2看出，在分枝期(5月下旬)和现蕾期(6月下旬)，经EMS诱变后有88.89%处理的赶黄草株高低于对照。其中分枝期的EMS浓度1.1%+诱变15 h后的植株最矮，较对照降低40.87%。经EMS诱变后果期(9月下旬)有61.11%的处理植株高度高于对照。诱变后的赶黄草在分枝期植株直径均小于对照；现蕾期有55.56%的植株大于对照，最大株直径处理为EMS浓度0.3%+反应时间15 h(9.03 mm)；果期有77.78%植株直径较对照有提升，EMS浓度0.9%+诱变15 h处理的植株直径最大(11.83 mm)。

经EMS诱变后的赶黄草较对照在成长初期矮小瘦弱，到现蕾期逐渐粗壮，果期高大粗壮，株高与植株直径多优于对照。因此，植株发生歪斜的概率更小，更加抗倒伏。EMS浓度0.9%+反应时间15 h处理的材料在成长期株高适宜、果期植株直径最大，可作为赶黄草抗倒伏材料的候选。

表2 经EMS诱变后赶黄草的株高和株直径Table 2 Plant height and diameter of P.chinense treated with EMS

2.3 经EMS诱变后赶黄草的产量

从表3看出，经EMS诱变后赶黄草小区总鲜重有61.11%的低于对照，但有66.67%叶鲜重等于或高于对照，其中EMS浓度0.3%+诱变15 h处理的叶鲜重增产最大，较对照增加30.19%；77.78%处理的叶比重高于对照，其中EMS浓度1.1%+诱变15 h的处理最大，较对照增加28.36%。说明EMS诱变在促进赶黄草分枝及增加叶比重方面有突出效果。根据目前市场观察，赶黄草以叶片需求为主，其经济价值主要体现在叶片重量上，故EMS诱变对于提高赶黄草叶产量有较大优势。EMS浓度0.3%+诱变15 h处理叶鲜重较对照增产30.19%，在经济价值上有较大优势，可作为叶用型赶黄草高产量材料的候选。

表3 经EMS诱变后赶黄草的小区产量和叶比重Table 3 Yield/plot and leaf mass per area of P.chinense treated with EMS

2.4 EMS诱变剂对赶黄草品质的影响

绘制标准曲线y= 29.87x+ 0.011，r=0.999 5。方法学考察结果：仪器精密度良好，试验方法重复性和稳定性良好。

经方差分析，总黄酮含量的FEMS浓度= 0.779 0F0.05；槲皮素含量的FEMS浓度= 0.718 0

表4 经EMS诱变后赶黄草的总黄酮和槲皮素含量Table 4 Total flavonoid and quercetin content of P.chinense treated with EMS %

3 结论与讨论

试验结果表明，赶黄草不同农艺和品质性状对EMS诱变浓度及反应时间有不同的需求：对发芽率而言，EMS浓度显著而反应时间不显著，0.5%为最优EMS浓度水平；对于植株高和植株直径，EMS浓度0.9%+诱变15 h处理的株高适宜，果期株直径最大，拥有最佳抗倒伏能力，可作为优秀育种亲本材料；EMS浓度0.3%+诱变15 h处理小区叶鲜重产量最高；对于总黄酮和槲皮素含量，赶黄草中总黄酮与槲皮素含量对EMS反应时间较敏感，其中EMS浓度0.5%+诱变10 h处理的总黄酮最高，EMS浓度0.1%+诱变15 h处理的槲皮素含量最高。可以看出EMS诱变浓度和时间在范围设计上并不十分合理，还有较大改进空间。反应浓度应在0.1%之前增加梯度，在0.9%之后减少梯度，并且以0.5%为核心浓度，改进的浓度范围为0.05%～0.9%。大部分最优材料反应时间集中在15 h，故应在15 h之后增加梯度，改进的时间范围为10～30 h。

研究参考《四川省中药材标准》及部分研究将总黄酮和槲皮素作为赶黄草有效成分指标。而近年来许多研究提出，应考虑将总黄酮中的赶黄草酮B[18]和没食子酸[19-20]等也作为指标成分。故在今后的研究中，应以更丰富的指标成分对赶黄草进行测定与研究。

本试验主要从诱变后代的田间性状及有效成分含量变化情况分析赶黄草的诱变特性，并未从分子层面对这些突变体产生的机理及其遗传物质的改变进行研究，尚需进一步对赶黄草DNA进行损伤程度判定及变异程度分析，有利于深入认识EMS对于赶黄草的诱变作用，为赶黄草的新品种选育奠定更多基础。