地锦褐斑病病原菌鉴定及病害诊断

吴石平, 莫砚成, 饶 岸

(1.贵州省农业科学院 贵州省植物保护研究所,贵州 贵阳 550006；2.北京师范大学贵阳附属中学,贵州 贵阳 550081)

地锦(ParthenocissustricuspidataPlanch)是一种重要的绿篱植物，常攀缘在墙壁、围墙、道路音障墙等处，在生态文明建设和城市美化上发挥着重要作用，是城市绿化不可缺少的景观植物。近年，一种褐斑病在地锦上普遍发生，病害发生后在叶片形成大量的褐色病斑，极大影响了其绿化效果和生态功能。目前未见该病原鉴定和诊断方面的报道。为了明确褐斑病病原，对今后该病的深入研究及防治提供理论支撑，对其病病原菌进行了分离鉴定及病害诊断。

1 材料与方法

1.1 标本的采集

在地锦褐斑病发病盛期采集症状典型的病叶标本，采集地点为贵阳市药用植物园及贵州省植物园。

1.2 菌株的分离及培养

选取典型病斑，在显微镜下挑取分生孢子器，放入无菌水中压碎，制成孢子悬浮液，将孢子悬浮液涂到水琼脂(WA)平板上。2 d后逐日检查孢子萌发情况，待孢子萌发后，挑取单个萌发的孢子接种到PDA培养基上，25℃避光培养。

1.3 病原菌的验证

参照《植病研究方法》[1]，采用科赫氏法则验证分离到的菌株是否为该病病原菌。

1.4 形态观察

将分离纯化的菌株用直径8 cm的灭菌打孔器，从菌落边缘打块，将含有生长旺盛的菌丝的PDA小块。接入PDA平板中央。每菌株5个重复。于28℃培养。第10天时测量菌落直径，观察菌落形态；然后挑取分生孢子器制片，在显微镜下观察分生孢子器、产孢结构及分生孢子的形态和大小。

1.5 分子系统学研究

参照Cubero[2]的方法提取菌株的总DNA。采用多聚核苷酸链式反应(PCR)扩增核糖体RNA转录间隔区(ITS)基因、延伸因子(TEF)、肌动蛋白基因(ACT)、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(GPDH)[3]，PCR产物由北京诺塞基因有限公司进行测序。采用MAFFT[4]对各菌株的4个基因序列以及在GenBank下载的相关的序列进行比对。为实现排序匹配的最优化，用手工校正。然后将4个基因的序列进行拼接，采用GBlocks删除不可靠的序列信息；采用PAUP4.0 beta 10[5]软件以最大简约法(Maximum parsimony,MP)进行分析，采用RaxmlGUI以最大似然法(maximum likelihood,ML)[6]构建系统树，选取结构较为合理的系统树，将ML和MP自举得到的分支支持率标记在系统树上。

2 结果与分析

2.1 菌株分离

通过对贵州省药用植物园和贵州省植物园采集到的标本进行分离和纯化，共分离到GZCC6.1728、GZCC6.1729、GZCC6.1730和GZCC6.1731菌株，4菌株的菌落生长速度、色泽、分生孢子器、孢子形态等一致。

2.2 科赫氏验证

选取菌株GZCC6.1728的孢子悬浮液，接种到幼嫩的地锦叶片上，5 d后叶片上形成明显的褐色病斑与采集到的标本基本一致，无菌水对照未出现病斑。10 d后病斑上开始出现分生孢子器，15 d后在接种的病叶上挑取分生孢子器，显微镜观察发现分生孢子器、分生孢子与出发菌株的分生孢子器及分生孢子形态上一致，分离长出的菌落得到菌株GZCC6.1732，该菌株与接种菌株GZCC6.1728生长速度、菌落形态和颜色一致，对ITS、TEF、ACT和GPDH 4个基因测序比对结果显示，2菌株的4个基因序列完全一致。

2.3 菌种鉴定

2.3.1 形态观察 病斑上病原菌分生孢子器形态球形或扁球形，130～280 μm，埋生或半埋生，分生孢子梨形到长椭圆形，(6～9.5)μm×(9～13)μm，单孢，无色，透明，内含油滴，表面隆起，有胶质鞘包围，尾部有附属丝，有时孢子没有胶质鞘包围和附属丝。

注：A 叶片病斑，B 叶背症状，C 病斑放大(示分生孢子器)，D、 E为分生孢子器切片，F分生孢子，G分生孢子在水琼脂上萌发，H菌落正面，I菌落反面。Note:A,leaf spots; B,symptoms of blade back ; C,disease spots after amplification(Pycnidium); D,E,section of pycnidium; F,conidia; G,conidia on water agar; H,face of colony; I,back of colony.图1 地锦叶斑病叶片症状及病原菌Fig.1 symptoms and pathogen with leaves of Brown Patch of P.tricuspidata

PDA培养基上的菌落圆形，边缘花瓣状，气生菌丝绒状；菌落正面青灰色至黑色，有叶点霉属真菌特有的金属光泽，背面黑色。在生长后期菌落上形成分生孢子器，散生于菌落中，分生孢子器深褐色至黑色，球形、扁球形或管状，105～280 μm，产孢细胞(3～7)μm×(3.5～15)μm，分生孢子卵圆形至长椭圆形(5.5～9)μm×(8～14)μm，单孢，无色，透明，内含油滴，表面隆起，有胶质鞘包围，尾部有附属丝，该菌在形态上与地锦叶点霉形态基本一致(图1)。

2.3.2 分子系统学分析 将分离到的4个菌株和科赫氏验证分离到的1个菌株及近缘种12个菌株及外群BotryosphaeriaobtusaCMW8232共18个菌株的ITS、ACT、EF和GPDH 4个基因对齐连接后，序列总位点数为1 503个，其中保守位点为1 062个，无简约信息位点282个，最大简约信息位点数159个，运用PAUP软件采用最大简约法分析得到系统树，该树长(Tree length)、一致性指数 (CI)、同型指数(HI)、保留指数 (RI)、重标定指数(RC) 分别为645、0.798 4、0.201 6、0.746 7和0.596 9，参与构建系统树的近缘种均以较高的支持率形成分支。

注：分支上的数值为最简约树的自举支持率(MPBS)和最大似然法的自举支持率(MLBS)，未标注表示自举支持率小于50%，加“*”的菌株为模式菌株。Note:Values of every branch were MPBS and MLBS,and nothing of every branch were less than 50%.Names of strain with * were the type strains.图2 地锦褐斑病病原菌及近缘种菌株多基因分子系统树Fig.2 Pathogen of brown patch of P.tricuspidata and polygene molecular phylogenetic tree of Strain with relative species

从地锦病斑上分离到的4个菌株(GZCC 6.172 8、GZCC 6.172 9、GZCC 6.173 0)GZCC 6.173 1)，以及回接发病后的病斑上分离到的菌株(GZCC 6.173 2)均与地锦叶点霉(P.partricuspidatae)聚在一支，最简约法(MP)和最大似然法(ML)的自举支持率均为100%，该分支与近缘种以较高的支持率与P.parthenocissi构成姊妹支(图2)。

3 结论与讨论

地锦(ParthenocissustricuspidataPlanch)是一种重要的绿篱植物，也称为爬山虎，我国大部分省区均有分布。该植物抗病性较强，报道的病害较少。高国平等[7-11]报道了地锦叶斑病的病原菌为马卡假尾孢(PseudocercosporamacadamiaeDeighton)；Gullino等[8]报道了由Cercosporaampelopsidis、Passalorabougainvilleae、Passaloradubia等病原菌引起的地锦叶斑病，但未见地锦褐斑病的报道。蔡祝南等[12-14]等描述了爬山虎叶斑病病原菌为常春藤叶点霉(P.hedericola)，经比较，地锦褐斑病病原菌孢子较大，病斑颜色较深，症状有差异。同时，常春藤叶点霉(P.hedericola)目前分类地位不属于叶点霉属真菌[15]。邱宁宏等[16]鉴定了爬山虎叶斑病病原菌为爬山虎叶点霉(P.allescher)，该菌与本研究的差异较大，不是同一种病害。

通过对病斑症状观察和发生流行分析发现，地锦褐斑病有明显的扩展过程，发病程度轻重有差异，发生期较长，发病过程由轻到重；发病范围广，病健部分界明显，病斑上有小黑点，为真菌的分生孢子器，内有大量叶点霉属真菌孢子。通过科赫氏法则，证实了该菌为引起病害的病原菌。该病的主要特征为：病斑圆形或不规则形，3～20 mm,病部植物组织坏死，病斑正面中央浅褐色至黄褐色，边缘深褐色；散生或轮生小黑点(分生孢子器))；病斑背面与正面色泽一致，也能产生分生孢子器，严重时多个病斑愈合形成大斑。

从室外病叶和科赫氏验证分离到的菌株，在分生孢子器、产孢结构、孢子的大小和形态、菌落形态和生长习性等方面的特征，与地锦叶点霉相符合，分子系统学研究表明分离到的菌株与地锦叶点霉聚为一支。因此，引起地锦褐斑病的病原菌鉴定为地锦叶点霉(P.partricuspidatae)。