miRNAs与血管损伤及血管重塑

陆洲成 桂培根

（南华大学附属第二医院，湖南衡阳421001）

人体内血液的流动需要血管。而血管在很多心血管疾病如动脉粥样硬化、高血压和血管成形术后再狭窄等中也扮演着重要角色。关于血管损伤和重塑的分子机制已经研究了近10年，并且取得了重大进展。据报道，许多基因参与调节血管重塑和血管生成，其中miRNA在血管损伤以及重塑中也起到重要作用，并且成为科学研究的新焦点[1]。

根据最近在人类基因组领域的发现，人类基因组近60%的转录本并不编码蛋白质，这部分不编码蛋白质的转录本被称为非编码RNA。生物信息学研究表明，非编码RNA在复杂的生物体内存在的数量更多。功能研究表明，非编码RNA在调控表观遗传过程中具有重要作用，是生命活动的重要调控因子。在非编码RNA中，miRNAs的功能最为突出，因此受到了广泛的研究。在本综述当中，对miRNAs在血管功能维护、损伤、重塑和血管生成中的功能做一总结。此外，本综述还对miRNAs在治疗动脉粥样硬化、高血压和其他血管相关疾病中的作用做一总结。

1miRNAs

miRNAs的核苷酸组成在20-25bp之间，几乎存在于所有生物体中，广泛参与基因表达的转录后调控。在动物细胞中，miRNAs从基因组转录为primiRNA，并在细胞核内由Drosha-DGCR8复合物加工成60-70bp具有发夹结构的pre-miRNA。进而通过Exportin-5核转运蛋白将pre-miRNA从细胞核转移到细胞质，胞浆当中的Dicer蛋白能够将前体pre-miRNA切割成双链分子。双链RNA的两条单链分离，其中一条单链会被降解，另一条链则被整合到RNA诱导沉默复合体(RISC)当中，RISC通过碱基配对原理与mRNA的3'UTR相互作用，诱导mRNA的降解或翻译抑制。自1993年在秀丽隐杆线虫 (Caenorhabditiselegans)中发现第一个miRNA以来，转录组高通量分析被广泛应用于miRNA的研究当中，使得新发现的miRNAs的出现呈现爆发式增长[2]。到目前为止，在miRBase 20.0数据库中已经注册了超过1800个人类物种的miRNAs。生物信息学分析表明，一个miRNA可能直接抑制数百个目标基因的表达。此外，至少有三分之一的mRNA可以被miRNAs调控，提示miRNAs可以调控许多重要的细胞活动和基本病理生理过程。

2 miRNAs对血管内皮细胞的调控

血管内皮细胞是血管表面的一层上皮细胞。因此，了解内皮细胞在血管疾病中的作用机制对于制定治疗心血管疾病的策略至关重要[3]。Dicer蛋白是miRNAs成熟的关键酶，对Dicer进行敲除会引起内皮细胞中miRNAs的缺失，进而影响胚胎内的新生血管生成，导致胚胎死亡，这意味着miRNAs对于维持内皮细胞的功能至关重要。部分miRNAs能够调节血管内皮细胞的一些表型，如增殖、迁移和细胞间黏附等细胞相互作用，进而影响初始的血管网络形成。这些miRNAs主要包括miR-21，miR-24，miR-34a，miR-92a，miR-126，miR-200b 以及 miR-210[4]。这部分miRNA通过抑制血管内皮细胞的增殖和迁移来抑制血管生成，例如miR-21通过靶向PPAR-α和RhoB来抑制血管内皮细胞增殖[5]。miR-200b通过下调 Ets-1、VEGF、VEGFR-2 和 GATA2 基因的表达抑制血管内皮细胞增殖。miR-92a通过抑制整合素α5亚基的基因表达抑制细胞生长[6]。而miR-221/222通过负调控c-kit的表达抑制内皮细胞增殖[7，8]。此外，除了通过调控GATA2抑制血管生成之外，miR-24还通过靶向PAK4诱导细胞发生凋亡。而miR-34a通过抑制SIRT1基因表达来组织血管生成，对于内皮细胞的衰老过程具有重要意义。

而另外的一些miRNA则被证明可以促进血管生成。例如，miR-126通过直接调控靶基因p21激活激酶(PAK1)的表达来调控血管的完整性以及血管生成的过程。根据另一项研究的结果，miR-126敲除小鼠心肌缺血后出现血管生成和增殖缺陷。因此，miR-126敲除小鼠不能向缺血心肌提供足够的营养和氧气，导致miR-126敲除小鼠死亡率显著增加。同样，在低氧条件下，miR-210在内皮细胞存活、迁移和分化以及管腔形成过程中起关键的调节作用。除了上述的miRNAs外，其他miRNAs也参与内皮细胞表型的调控。例如miR-16，miR-424。miR-130 a以及Let-7等。

3miRNAs调节血管平滑肌细胞（VSMC）的增殖、迁移以及表型转化

除了直接调控内皮细胞的基因表达之外。众多研究表明，多种miRNAs能够调节血管活性分子、细胞因子、基质金属蛋白酶和生长因子的表达，进而对血管平滑肌细胞的增殖和迁移进行调节。例如在血管平滑肌细胞中敲除Dicer会导致胚胎死亡，并且胚胎的组织学检测结果显示有明显的血管发育异常。这些研究结果提示miRNAs在血管平滑肌细胞的增殖、迁移和表型转化中发挥重要作用。而也有很多研究结果表明如 miR-21、miR-133、miR-143/145、miR-221/222和miR-663等都在VSMC的功能中起到了至关重要的作用[4，9]。在PDGF处理下，miR-221/222表达显著上调，而miR-133、miR-143/145和miR-663表达显著下调。miR-221/222表达上调能够直接抑制细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白p27Kipl和p57Kip2的表达，进一步造成了VSMC增殖及迁移的增加，同时抑制血管平滑肌细胞生物标志物的表达[10]。同样，miR-21的过表达也促进了VSMC的增殖，进而减少了细胞的凋亡。另一方面，miR-133通过抑制转录因子Sp-1的表达来抑制血管平滑肌细胞的增殖和迁移[11]，而miR-143/145通过直接抑制转录因子KLF4/5表达来抑制血管平滑肌细胞增殖并促进血管平滑肌细胞的分化，导致新生内膜形成受阻，进而导致颈动脉球囊损伤[12]。进一步通过敲除实验进行验证，发现miR-143/145在敲除之后血管平滑肌细胞的收缩功能能够被回复[13]。而miR-663能够通过抑制转录因子JunB和肌球蛋白轻链9的表达，促进血管平滑肌细胞的分化，抑制PDGF诱导的血管平滑肌细胞增殖和迁移。这些研究表明，miRNAs在血管内皮细胞和血管平滑肌细胞这两种主要的血管类型细胞中发挥重要作用，提示miRNAs可能参与病变血管损伤、重塑和血管生成等过程，并且可能参与动脉粥样硬化、高血压和血管成形术后再狭窄等病理过程。

4miRNAs与血管相关性疾病

内皮损伤和血管管腔狭窄是引起动脉粥样硬化、高血压、肺动脉高压（PAH）等心血管疾病的主要原因。迄今为止，许多miRNAs已被证明参与了这些病理过程。动脉粥样硬化是血管内皮损伤引起的最常见的动脉综合征之一，它涉及炎症、脂质沉积、纤维化和斑块形成等多种复杂的病理过程，一些miRNAs已经被证明与这些过程相关。例如国外研究报道了在急性冠脉炎形成的早期，YY1/HDACs/miR-155/HBP1信号通路参与了泡沫细胞的形成过程[14]。研究中发现miR-155在动脉粥样硬化(ApoE-/-)小鼠的巨噬细胞中表达水平显著上调，并且miR-155介导了巨噬细胞中oxLDL诱导的脂质摄取以及ROS的产生。更重要的是，通过miR-155拮抗剂对巨噬细胞中的miR-155表达进行沉默可以明显降低巨噬细胞的脂质水平，进而减少小鼠动脉粥样硬化的发生。研究结果提示miR-155可能是动脉粥样硬化的潜在治疗靶点。与此同时，有研究发现在动脉粥样硬化(ApoE-/-)小鼠中特异性敲除白细胞中的miR-155能够显著减少血小板细胞的大小和病变巨噬细胞的数量。其分子机制主要是通过减少趋化因子CCL2的表达实现的。与之相反，在高脂喂养的动脉粥样硬化(ApoE-/-)小鼠中，miR-181b在主动脉内膜的表达显著减少。miR-181b通过直接抑制importin-a3（NF-κB核转位所需蛋白）的表达，抑制内皮细胞中NF-KB应答基因的表达，如VCAM-1和E-selectin。研究结果表明，在机体内转入miR-181b可以有效抑制动脉粥样硬化的发生发展。这些研究表明，调控miRNAs可能为动脉粥样硬化提供一种新的治疗方法。高血压和肺动脉高压是由血管重塑造成的，并且血管重塑往往还会继续发展使得高血压和肺动脉高压进一步恶化。最近的研究表明多种miRNAs参与高血压和肺动脉高压的发生发展过程，例如 miR-130a、miR-145、miR-155、miR-20、miR-424和miR-503。在自发性高血压小鼠以及血管紧张素II诱导的血管平滑肌细胞中，miR-130a的表达显著上调。抑制miR-130a的表达能够显著抑制血管紧张素II诱导的血管平滑肌细胞的增殖以及血管重塑[15]。而在自发性高血压大鼠体内miR-155表达下调，而过表达miR-155能够抑制血管紧张素II1型受体表达，进而抑制高血压的形成[16]。多种miRNAs参与PAH的发生发展，其主要是通过调节细胞因子和生长因子来实现的，是因为它们可以作用于血管内皮细胞或血管平滑肌细胞[17]。在患有PAH的人或啮齿类动物的肺血管平滑肌细胞中，miR-204的表达显著下调。miR-204表达的下调与PAH的严重程度密切相关。在髓内动脉内皮细胞中过表达miR-424或miR-503可使内皮细胞进入静息状态，抑制内皮细胞招募血管平滑肌细胞的能力，并且通过直接抑制FGF2和FGER1表达减少PAH的发展。与之相反，miR-145在PAH患者以及PAH小鼠的肺组织中表达显著上调。miR-145的沉默会导致右心室收缩压降低以及右心室肥大，并且对肺血管重塑也有一定作用。这些研究表明对miRNAs表达进行调控可能是治疗高血压以及PAH的新型策略。

今年的一些研究表明miRNAs在一些疾病发生发展过程中具有一定的协同作用。例如，CD44的3’UTR 可以结合 miR-216a、miR-330 和 miR-608，进而影响CDC42的表达，从而调控人乳腺癌细胞系MT-1的增殖、凋亡及血管生成的表型[18]。这些研究结果显示miRNAs可能在血管重塑的过程中存在相互联系。然而目前还没有直接的实验证明miRNAs在血管重塑中具有协同作用。但是有报道称有几种miRNAs能够靶向参与血管损伤及相关疾病的同一基因，如miR-217和miR-34a[19]均能靶向Sirt1诱导内皮细胞衰老[20]。因此，研究miRNAs在血管重塑过程中的协同效应是今后一个非常有价值的方向。

5 血清中的miRNAs可以作为血管疾病的生物标志物

由于miRNA在血浆中表现出很高的稳定性，有可能利用这一特性开发血管疾病的分子标记物。根据文献报道，已经发现miR-208a可以作为心肌缺血的血清标志物，且灵敏度高和特异性也较好[5，6]。同样，在PAH患者的血浆中多种miRNAs含量也发生显著变化[21]。已经有各项研究证明，在PAH患者血清当中，多种miRNAs含量是下调的，例如miR-451和miR-1246，而另外一些miRNAs含量则是上调的，例如miR-23b、miR-130a和miR-191。这些研究对于miRNAs在临床上作为PAH的生物标志物具有重要意义。目前对于PAH的诊断方法仍然采用的是在X射线透视下进行右心导管插管检查，操作上极为繁琐且对主治医师的手术技术要求较高。因此开发出更加简单且高效的PAH诊断方法就显得尤为迫切，寻找特异性高以及敏感度好的血浆标志物可能是很好的一个方向。虽然有研究报道PAH患者血浆中的miRNAs可以作为生物标志物，但是对于miRNAs作为PAH标志物其灵敏度以及特异性等特性都需要临床研究进行检验，目前在这一方面仍然缺乏足够的临床研究。

6 问题与展望

目前对于miRNAs在心血管疾病当中的研究已经非常深入及广泛，但仍存在许多限制其大规模临床应用的问题。首先是因为一个miRNA可能针对数十个甚至数百个基因，因此人为干预miRNA的表达可能会导致一系列下游基因的变化，从而对人体造成不可预知的伤害。此外，人工修饰的miRNAs对人体是否会造成毒副作用也尚未确定。miRNA的脱靶效应会对人体造成何种影响目前也不是特别清楚。其次目前关于miRNA在体内代谢上的药代动力学了解得还不够。因此，进一步的研究需要对miRNA的功能和机制做进一步更深入的研究，以便为miRNAs在血管重塑和稳态调节上的临床应用铺平道路。最近RNA领域的研究也主要集中在miRNAs对内皮细胞和VSMC的影响上。对miRNAs的研究范围应该进一步扩大到血管中的其他细胞成分当中，如成纤维细胞和巨噬细胞。