自身免疫性疾病患者检测PAI-1(4G/5G)，ABCB1(3435T>C)在预防甲强龙治疗发生股骨头坏死风险的应用*

张 莹，程晓东，胡玉皎，王 昊，周铁成，郝晓柯

(空军军医大学西京医院全军临床检验中心，西安 710032)

糖皮质激素可用于治疗多种自身免疫性疾病，但糖皮质激素冲击治疗或长期使用可能导致的股骨头坏死会给患者带来更大的痛苦，怎样合理有效的使用激素冲击治疗显得尤为重要。随着基因概念的提出和化学药物用药的深入研究，大量的研究表明由于基因存在的多态性导致同一药物对不同人群及个体所产生的效果和反应不同，而导致部分患者出现严重的不良反应。甲强龙的耐药位点PAI-1(4G/5G) 是纤溶酶原激活物抑制剂的效应分子，PAI-1(4G/5G)的突变与心脑血管疾病的发生有关[1-2]，与深静脉血栓的形成有关[3]，也有文献报道，PAI-1(4G/5G)的突变可导致股骨头坏死的发生[4-5]。甲强龙的耐药位点ABCB1(3435T>C) 是糖皮质激素的药物转运体，ABCB1(3435T>C)的突变会导致药物转运及代谢障碍[6]。使用激素甲强龙治疗的患者，这两个耐药位点基因的突变将会给患者带来严重的后果，有必要在用药前给患者做相应的化学药物耐药位点检测。

本文使用数字荧光检测仪和荧光染色原位杂交技术，实现小片段测序和SNP分型，检测甲强龙耐药位点PAI-1(4G/5G) 和ABCB1(3435T>C)，根据不同患者的基因型特性进行合理用药，达到提高药效、降低毒性和减少不良反应发生的效果，为甲强龙药物使用的患者提供精准的用药指导。

1材料与方法

1.1 研究对象 我院2016年8月～2018年1月接受甲强龙耐药位点PAI-1(4G/5G) 和ABCB1(3435T>C)检测的患者94例(其中天疱疮类疾病患者39例，皮肌炎类患者30例，系统性红斑狼疮患者25例)，男性37例，女性57例，平均年龄43.69±11.49岁。

1.2 试剂和仪器 试剂：10×NH4Cl预处理液，处理血液样本时用于裂解红细胞；耀金保(核酸纯化试剂)，用于在进行SNP分析前保存标本；耀金分(测序反应通用试剂盒)，用于数字荧光分子杂交、化学药物用药指导时的样本分析；软件设定液，用于制备标准曲线；阳性对照监测仪器是否在控。以上试剂均由北京华夏时代基因科技发展有限公司提供。仪器：TL998A荧光检测仪(西安天隆科技有限公司提供)。

1.3 方法

1.3.1 血液样本：2～3 ml静脉全血(不需空腹)，使用一次性真空采血管(EDTA抗凝紫帽管)采集，于4℃低温保存，保存时间不宜超过24 h。

1.3.2 标本前处理：在1.5 ml离心管中加入1.0 ml 1×NH4Cl预处理液，吸取200 μl混匀的全血，室温静置5 min，待红细胞完全破裂，液体颜色变为澄清的红色后3 000 r/min离心5 min。将上层透明红色液体吸取干净，向管底富集的白细胞团块中加入30 μl耀金保使白细胞的胞膜破裂。充分混匀，为了更好的使细胞核内的核酸游离出来，室温静置30～60 min，等待检测。

1.3.3 检测过程：样本检测：吸取1.5 μl处理后的白细胞样本加到相应的试剂中上机检测。阳性对照：吸取1.5 μl的阳性质控品分别加到对应的软件设定液中。阴性对照：吸取1.5 μl耀金保保存液，加到试剂中。

1.3.4 质控结果分析：阴性对照用以监测实验室和前处理过程中是否存在污染，检出结果应为“重测”；阳性对照用以监测实验能否正常检出阳性标本，检出结果应为阳性质控品的基因型。

1.4 统计学分析 收集、记录相关数据，录入SPSS 19.0 统计学软件对数据进行分析和相关处理，定性资料以百分率(%)表示，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 甲强龙化学药物基因位点检测结果 PAI-1(4G/5G)位点检测结果为5G5G的患者20人，占总人数的21.28%；检测结果为4G5G的患者43人，占总人数的45.74%；检测结果为4G4G的患者31人，占总人数的32.98%。ABCB1(3435T>C) 位点检测结果为TT的患者17人，占总人数的18.09%；检测结果为TC的患者44人，占总人数的46.81%；检测结果为CC的患者33人，占总人数的35.10%。激素甲强龙化学药物两个耐药位点间检测结果对于评估股骨头坏死的风险度差异无统计学意义(χ2=6.855，P=0.142)。

2.2 激素甲强龙化学药物各个基因位点检测结果风险度分布情况 对于PAI-1(4G/5G)基因，激素甲强龙冲击治疗引起股骨头坏死高风险的基因型是4G5G/4G4G，占78.72%(74/94)，5G5G基因型为低风险基因占21.28%(20/94)；对于ABCB1(3435T>C)基因，CC基因型为高风险基因，占35.10%(33/94)，TT/TC基因型为低风险基因，占64.90%(61/94)。

PAI-1(4G/5G)和ABCB1(3435T>C)基因均为高风险基因型时，患者进行激素甲强龙冲击治疗时引起股骨头坏死的风险为高风险；PAI-1(4G/5G)和ABCB1(3435T>C)基因有一个为高风险基因型时，患者进行激素甲强龙冲击治疗时引起股骨头坏死的风险为中等风险；PAI-1(4G/5G)和ABCB1(3435T>C)基因均为低风险基因型时，患者进行激素甲强龙冲击治疗时引起股骨头坏死的风险为低风险。

故激素甲强龙的用药情况，12.77%(12/94)的患者进行激素甲强龙冲击治疗时引起股骨头坏死的风险为低风险；60.63%(57/94)的患者进行激素甲强龙冲击治疗时引起股骨头坏死的风险为中等风险，在进行治疗时需要关注骨骼反应；但是还有26.60%(25/94)的患者进行激素甲强龙冲击治疗时引起股骨头坏死的风险是高风险，需高度关注骨骼反应，同时配伍用双膦酸盐，降低激素剂量并换用其他药物，也可使用阿司匹林等药物进行治疗降低风险。

3讨论糖皮质激素冲击治疗可用于治疗系统性红斑狼疮、全身性皮肌炎(多发性肌炎)、天疱疮、严重的多形红(Stevens-Johnson综合征)、剥脱性皮炎、大疱疹性皮炎、严重的脂溢性皮炎、严重的银屑病、蕈样真菌病、荨麻疹等皮肤病。但是激素冲击治疗或长期使用可能导致的股骨头坏死会给患者带来更大的痛苦，合理有效的使用激素治疗显得尤为重要。随着精准医疗概念的提出，化学药物用药的深入研究，发现基因多态性的存在，导致同一药物对不同人群及个体所产生的效果和反应不同，导致部分患者出现严重的不良反应。

甲强龙的耐药基因PAI-1(4G/5G) 是纤溶酶原激活物抑制剂(plasminogen activator inhibitor，PAI)-1的效应分子，PAI-1是血浆纤溶系统中主要的一种抑制物，可以控制和降低纤溶系统的活性，通过PAI-1的调节作用，维持纤溶系统的动态平衡，才能保持血浆纤溶活性。因此，血液循环中PAI-1水平异常，就容易诱发血栓形成[7-8]。股骨头本身血液供应有限，如并发血栓风险则会大大提升坏死风险。PAI-1(4G/5G) 基因突变，血浆纤溶活性降低，血栓形成，股骨头血液供应减少，股骨头坏死风险提高[9-10]。

甲强龙的另一个耐药基因ABCB1(3435T>C) 是多耐药基因1的3435位点，是糖皮质激素药物转运体。ABCB1位于第7号染色体长臂上，含29个外显子，位于26号外显子C3435T位置的许多个单核苷酸多态性SNP位点最被广泛研究。内源性及外源性的糖皮质激素均是P-gp的转运底物，CROWE等[11]研究显示，在Caco-2细胞株中，激素向细胞内的渗透受P-gp的限制，ABCB1基因的敲除或表达降低，均使组织或细胞内激素的浓度降低。GONG等[12-13]对ABCB1(3435T>C)基因多态性与糖皮质激素性股骨头坏死的研究进行了分析，结果显示C等位基因增加了糖皮质激素诱导股骨头坏死的相关性，我国学者也做了类似的研究。

本文研究结果显示，根据激素甲强龙PAI-1(4G/5G) 和ABCB1(3435T>C) 2个耐药位点对患者进行糖皮质激素冲击治疗时风险的评估是一致的。根据2个耐药位点对风限度的评估，12.77%的患者进行激素甲强龙冲击治疗时引起股骨头坏死的风险为低风险，60.63%的患者进行激素甲强龙冲击治疗时引起股骨头坏死的风险为中度风险，在进行治疗时需要关注骨骼反应，一旦有不良反应征象，即配伍用双膦酸盐，而26.60%的患者进行激素甲强龙冲击治疗时引起股骨头坏死的风险为高风险，这些患者进行激素甲强龙冲击治疗时需高度关注骨骼反应，同时配伍用双膦酸盐，降低激素剂量并换用其他药物，也可使用阿司匹林等药物进行治疗降低风险。实验数据显示在进行激素甲强龙冲击治疗前给患者作甲强龙化学药物基因检测，根据检测结果合理精准用药，可以使26.60%的患者避免股骨头坏死风险的出现，为患者提供安全的用药指导。