电针对APP/PS1小鼠学习记忆及β位淀粉样前体蛋白裂解酶1表达的影响

黄盛，李珑，王志福，杨敏光，李建鸿，张嘉泳，陈立典

1.福建中医药大学康复医学院，福建福州市350122；2.福建省康复技术重点实验室，福建福州市350122；3.福建康复产业研究院技术创新平台，福建福州市350122；4.国家中医药管理局中医康复研究中心，福建福州市350122

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一种年龄相关，以学习记忆等认知功能进行性下降为特点的中枢神经系统退行性疾病[1]；病理学特征为老年斑形成、神经纤维缠结、神经元及突触丢失。其中β 淀粉样蛋白(β-amyloid protein,Aβ)的异常积累可以触发神经纤维缠结形成和老年斑块沉积和神经元退行性变，从而导致学习记忆等认知功能障碍。β 位淀粉样前体蛋白裂解酶1 (β-site amyloid precursor protein cleaving enzyme 1, BACE1)是淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)裂解为Aβ 的限速酶和关键酶[2-3]。针刺人体特定穴位，可以产生明显的神经保护作用，对AD 等多种神经退行性疾病均可有效的延缓学习记忆等认知功能损伤[4-5]。

我们前期实验证实[6-7]，电针百会可改善APP/PS1小鼠大脑葡萄糖代谢，增强脑区神经元增殖、分化和突触联系，从而缓解学习记忆等认知功能障碍，本研究观察电针百会、神庭对APP/PS1 小鼠大脑BACE1表达及Aβ沉积的影响，进一步探讨电针改善AD学习记忆能力的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

雄性APP/PS1双转基因型小鼠24只，体质量(35±2) g，相同背景、月龄野生型小鼠8 只，均购自南京大学模式动物研究所，饲养于福建中医药大学实验动物中心SPF级实验室，许可证号SYXK(闽)2014-001。APP/PS1 小鼠编号1～24，以随机数字表任一数字为起始编号，以抽取的数字除以3，所得余数为0、1、2，相应分到模型组、电针组、非穴组，各8 只；8 只野生型小鼠为野生组。实验过程中，饲养、干预、牺牲等均严格遵守动物福利与伦理准则和指南的相关规定。

1.2 主要试剂和仪器

Aβ 和BACE1 抗体：美国ABCAM 公司。DAB 免疫组化试剂盒：福州迈新生物技术开发有限公司。华佗牌SDZ-Ⅴ电针治疗仪、0.5 寸铜柄毫针。RNA 提取试剂盒、逆转录试剂盒：美国Ⅴazym 公司。BACE1及GADPH 引物：上海生工生物有限公司。Morris 水迷宫：中国医学科学院药物研究所。

1.3 方法

电针组以30 号毫针斜行刺入百会、神庭[8]，深约0.5 mm，针柄连接电针仪，百会接正极，神庭接负极。取电压2 Ⅴ，疏密波，频率1 Hz 和20 Hz。每次30 min，每天1次，共28 d。

非穴组取双侧胁下非经非穴点，左侧接正极，右侧接负极，参数与电针组相同。野生组和模型组予同等时间和程度的抓取、固定，不予特殊处理。

1.4 Morris水迷宫

水迷宫水池呈圆筒状，池壁上4 个等距离点分水池为4 个象限，平台直径6 cm，放置于第三象限，没于水面下2 cm，水温(22±2)℃。摄像系统悬于水迷宫圆心正上方。

1.4.1 定位航行实验

将小鼠按顺时针方向顺序从4 个象限面向池壁放入水中。如果小鼠在90 s 内找到平台并停留3 s 以上，记此为逃避潜伏期。如果小鼠90 s 内未能找到平台，将其引导到平台，熟悉15 s，逃避潜伏期记为90 s。共4 d。

1.4.2 空间探索实验

定位航行实验后第2 天撤去平台，小鼠从第一象限放入水中，以原平台所处位置为优先记录区域。记录90 s内小鼠穿过该区域的次数。

1.5 取材

干预及行为学测试结束后，每组取5只小鼠，4%异氟烷1 L/min 吸入麻醉，2 min 后夹捏小鼠皮肤，确认成功麻醉。左心室灌注生理盐水约50 ml，4%多聚甲醛继续灌注。迅速断头处死，剥离脑组织，4%多聚甲醛固定24 h，脱水、石蜡包埋，石蜡切片机冠状切片，厚5 μm。

各组其余3 只同法麻醉，快速取脑，生理盐水洗净，-80 ℃冻存。

1.6 Aβ测定

石蜡切片常规脱蜡，枸橼酸缓冲液热修复抗原10 min，冷却至室温；PBS 漂洗3 次，每次5 min；山羊血清封闭液封闭40 min，加Aβ 一抗(1∶1000) 4 ℃过夜；PBS漂洗；加抗鼠488二抗(1∶1000)37 ℃孵育1 h，PBS 漂洗；DAPI 封片剂封片。以PBS 代替一抗作为阴性对照。以大脑皮质为图像分析区域，每组取6 个视野，用Nikon 显微镜和Image J 图像分析系统进行图像采集和处理，测有效阳性面积。

1.7 BACE1测定

石蜡切片常规脱蜡，枸橼酸缓冲液热修复抗原10 min，冷却至室温；PBS 漂洗3 次，每次5 min；3% H2O2室温孵育10 min，PBS 漂洗；10%羊血清37 ℃孵育10 min；加BACE1 一抗(1∶300) 4 ℃过夜；PBS 漂洗；加生物素化二抗37 ℃孵育10 min，PBS 漂洗；DAB 显色，清水漂洗，苏木素染色30 s。脱水，封片。以PBS 代替一抗作为阴性对照。以大脑皮质为图像分析区域，每组取6 个视野，用Nikon 显微镜和Image J图像分析系统进行图像采集和处理，计数阳性细胞数。

1.8 BACE1 mRNA测定

取小鼠冻存脑组织200 mg，加裂解液1 ml充分研磨震荡；加氯仿200 μl，震荡混匀，4 ℃静置10 min；4 ℃、12,000 g 离心15 min；取无色上层溶液500 μl，加预冷异丙醇溶液500 μl，混匀，4 ℃静置20 min；4 ℃、12,000 g离心15 min，弃上清，白色沉淀加75%乙醇，轻轻吹打，反复洗涤管壁，悬浮沉淀，静置5 min；4 ℃、12,000 g 离心5 min，弃上清，干燥沉淀，加入DEPC 水20 μl充分溶解，核酸紫外分光光度计测定OD值。取RNA 1 μl加反应体系20 μl，合成cDNA。取cDNA 稀释后的标准品2 μl，加反应体系20 μl 扩增：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，变性、退火、延伸共30 个循环，最后70 ℃延伸5 min。

BACE1 引物序列：上游5'-CCG GCG GGA GTG GTA TTA TGA AGT-3'；下游5'-GAT GGT GAT GCG GAA GGA CTG ATT-3'。

GAPDH 引物序列：上游5'-TGG AAA GCT GTG GCG TGA T-3'；下游5'-TGC TTC ACC ACC TTC TTG AT-3'。

应用ABI Fast-7500 Real time PCR 仪测目的基因Ct值，计算ΔΔCt。

1.9 统计学分析

采用SPSS 21.0 统计软件进行统计学处理。数据均以(xˉ±s)表示。多组间比较采用单因素方差分析，方差齐时，组间两两比较采用LSD 检验，方差不齐时采用Dunnett's T3检验。显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1 Morris水迷宫

模型组较野生组逃避潜伏期时间显著延长(P ＜0.001)。与模型组小鼠相比，电针组逃避潜伏期显著缩短(P ＜0.001)，非穴组与模型组间无显著性差异(P ＞0.05)。见表1。

水迷宫轨迹图显示，野生组可以迅速判断平台所在位置，并迅速找到平台，轨迹清晰，目标明确；电针组与野生组轨迹图相近；模型组和非穴组轨迹紊乱，较难找到平台所在位置。见图1。

空间探索实验结果显示，模型组穿越平台次数较野生组显著减少(P ＜0.001)。与模型组相比，电针组穿越平台次数显著增多(P ＜0.001)。见表1。

2.2 Aβ测定

野生组未见明显Aβ 沉积。与模型组和非穴组相比，电针组Aβ 水平显著减少(P ＜0.001)。见图2、表2。

2.3 BACE1水平

模型组BACE1 水平显著高于野生组(P ＜0.001)。与模型组和非穴组相比，电针组BACE1 水平显著降低(P ＜0.001)。见图3、表3。电针组BACE1 mRNA水平也显著降低(P ＜0.001)。见表4。

表1 各组Morris水迷宫结果比较

图1 各组小鼠水迷宫定位航行轨迹图

图2 各组大脑皮质Aβ沉积(免疫荧光染色，200×)

表2 各组Aβ阳性面积比较(IOD)

表3 各组BACE1阳性细胞数比较

3 讨论

Aβ 的沉积启动病理级联反应；Aβ 蛋白寡聚化后形成淀粉样沉淀，导致突触功能障碍，神经元丢失，引起认知功能障碍[9-10]。减少或清除Aβ 可能是预防和治疗AD 的重要策略。AD 属于中医“呆病”，病位在脑。脑为元神之府，司视听、思维、记忆等认知相关功能；阳气充盈上行并填充髓海，是保持认知功能的重要基础。督脉循行于背部正中，与六阳经均有交汇；督脉通畅保证阳气充盈入脑，濡养髓海，可以保持或提升认知水平。百会为督脉要穴，为各经脉气会聚之处，有升阳举陷，益气固脱功效；神庭为督脉、足太阳和足阳明经之会，有宁神、开窍等功效。联合针刺百会、神庭两穴有益气升阳、填髓充脑、醒脑开窍之功效，达到改善认知功能的作用[11]。实验研究也发现[12-13]，电针或针刺可以改善AD小鼠的认知障碍。

APP/PS1 双转基因小鼠可以模拟AD 的病理过程，且表现出时间依赖性Aβ 沉积增多等病理特征，以及学习记忆能力缓慢下降等特点，是一种广泛应用于AD 基础研究的动物模型[14]。该动物模型将人21、14号染色体上的APP 及PS1 突变基因转入小鼠，加速Aβ 在脑内的产生，使APP/PS1 小鼠早期即出现可被检测的空间学习记忆能力减退。大部分实验研究表明[15-16]，4～5 月龄APP/PS1 小鼠表现出轻微行为学异常；而随着年龄增长，空间学习记忆能力下降越趋明显，6～8月龄海马区开始出现老年斑和Aβ沉积。因此本研究选取8月龄APP/PS1小鼠作为干预对象。

本研究显示，9 月龄APP/PS1 小鼠空间学习记忆能力下降，大脑皮质BACE1 表达增多，出现显著Aβ斑块沉积；电针百会、神庭可以影响BACE1 的表达，减少Aβ，减轻学习记忆损伤。与先前的研究相似[17-18]。

图3 各组大脑皮质BACE-1表达(免疫组化染色，400×)

表4 各组BACE1 mRNA表达比较

Aβ是由1型跨膜蛋白APP水解而来，水解过程由BACE1 启动。BACE1 与Aβ 的产生显著相关[19]。敲除BACE1的小鼠，Aβ沉积明显减少甚至无Aβ沉积[20-21]。通过siRNA 靶向BACE1 可减少APP 转基因小鼠Aβ 产生，延缓神经退行性变，改善行为缺陷[22]。电针大椎、肾俞也可以抑制BACE1 表达，从而改善SAMP8小鼠空间学习记忆能力[23]。传统中药治疗APPⅤ717小鼠同样发现降低BACE1表达水平，减少AD 模型小鼠脑内Aβ 沉积[24]。抑制BACE1 的表达还能有效减轻突触损伤、内体功能障碍和溶酶体-自噬系统损伤[25-26]。

BACE1 对AD 的影响机制复杂。本研究显示，电针可通过影响BACE1 的表达，减少Aβ 产生。电针是否可以通过影响BACE1 的表达从而对突触损伤、内体功能障碍等产生影响，还有待进一步研究。