microRNAs调节脑卒中后血脑屏障的研究进展

杨佳蕾，张秀芬，吴诗坡，侯利华，尹世敏

1.解放军火箭军特色医学中心，全军脑卒中医疗救治研究中心神经内科，北京100088；2.解放军总医院 海南医院妇产科，海南 三亚572013；3.军事科学院 军事医学研究院 生物工程研究所，北京100071；4.国家神经系统疾病临床医学研究中心，北京100070

血脑屏障是指脑血管内皮细胞、星形胶质细胞足突、周细胞及基膜组成的血液与脑组织之间的屏障，对保持脑组织内环境的稳定、调节脑组织的营养与代谢、维持中枢神经系统正常生理功能有重要意义[1]。在众多中枢神经系统疾病中，如脑卒中、阿尔兹海默症、脑外伤、脑肿瘤、脑小血管病，血脑屏障的结构及功能往往遭到破坏，导致脑组织炎性细胞浸润、脑水肿及脱髓鞘、氧化自由基损伤、神经元变性及神经细胞死亡[2-3]。作为我国居民第一位死亡原因，脑卒中具有高发病率、高致残率、高复发率的特点，探讨如何有效挽救受损血脑屏障，减轻或修复脑卒中后神经系统的损伤，具有重要的临床意义。microRNA（miRNA）是一类由19～24个核苷酸组成的非编码RNA，在神经系统发育过程中起重要的调控作用，如调节神经干细胞增殖、神经元及神经胶质细胞分化[4]。脑卒中后miRNA表达谱发生变化，上调其中的保护性miRNA或下调损伤性miRNA可以起到抗炎、抗凋亡、促进血管生成、促进神经再生的作用，提示miRNA不但是影响脑卒中病理生理过程的关键分子，而且可以作为药物干预靶点[5]。本文对miRNA调节脑卒中后血脑屏障的研究进展进行综述，以期为保护血脑屏障、减轻脑损伤、改善预后提供新的干预靶点。

1 血脑屏障

血脑屏障是外源物质进入中枢神经系统的第一道屏障，对进出脑组织的物质有滤过和筛选作用，对维持脑组织内环境的稳定有重要意义。脑血管内皮细胞之间位于顶部的紧密连接使内皮细胞形成完整的屏障界面，与细胞底部的黏附连接共同组成连接复合体。紧密连接蛋白主要包括闭合蛋白（occludins）、密封蛋白（claudins）以及辅助蛋白ZO 等，黏附蛋白主要为钙黏着蛋白（cadherins）。内皮细胞外周的基膜对内皮细胞起支撑保护作用，主要由胶原蛋白、层粘连蛋白、纤维连接蛋白等构成[6]。任何损伤血脑屏障结构的疾病，如脑卒中、阿尔兹海默症、脑外伤、脑肿瘤、脑小血管病，都可以导致内皮细胞间紧密连接开放、基膜被基质金属蛋白酶（MMP）消化崩解、星形胶质细胞足突回缩、血脑屏障通透性增加，继而引发炎症细胞浸润以及大量炎性因子释放、血管源性以及细胞源性水肿、神经细胞死亡以及神经功能障碍[7]。

2 miRNA

miRNA是一类序列高度保守的非编码RNA，其生物合成是一个多步骤过程。在RNA 聚合酶的作用下，DNA 转录为可长达几千碱基的PrimiRNA，接着由Drosha 复合物剪切成65～75个核苷酸、具有茎环结构的Pre-miRNA；Pre-miRNA被输出蛋白从细胞核转运到细胞浆，然后被Dicer 识别并对茎环结构进行剪切，形成具有功能的成熟单链miRNA。miRNA虽然短小，但是却可以通过碱基配对原则与靶基因的mRNA 3'非翻译区（3'UTR）结合，抑制靶基因mRNA的翻译，导致靶蛋白产量减少，在细胞代谢、增殖、分化、死亡等各个生命活动中发挥重要的调控作用。一个miRNA可以有多个靶基因，一个基因也可以受到多个miRNA的影响，从而构成交错复杂的调控网络。理论上，人类基因中可能有超过三分之一的基因受到miRNA调控[8]。在病理过程中，miRNA表达谱发生变化，越来越多的研究关注到miRNA作为生物标志物在疾病早期诊断、判断疾病分期与病情轻重、监测治疗效果与评价新疗法中的作用。对miRNA在疾病过程中发挥的作用以及调控机制进行深入研究，将有助于发现更多更优的诊治靶点[5]。

3 miRNA与脑卒中

脑卒中是一种导致神经功能障碍的血管性中枢神经系统疾病，包括缺血性脑卒中和出血性脑卒中。缺血性脑卒中较出血性脑卒中更常见，占脑卒中人群的70%～80%。脑组织缺血缺氧可以导致脑血管内皮功能障碍，内皮细胞间的紧密连接受到破坏，导致血管源性水肿，血脑屏障通透性发生改变，炎性因子浸润、基质金属蛋白酶及环氧合酶激活、活性氧自由基的产生都影响着脑卒中后血脑屏障损伤的病理进程[9]。而在此过程中，miRNA表达谱发生变化，进而通过调节下游分子的表达影响该病理过程[10]。

3.1 miRNA与缺血性脑卒中

在缺血性脑卒中后，脑血管内皮细胞的紧密连接往往首先受到影响，miRNA则可以通过影响紧密连接相关蛋白（如ZO-1、闭合蛋白和密封蛋白等）影响血脑屏障通透性。既往研究报道，在体外原代培养人脑血管内皮并制作氧糖剥夺模型，通过转染miR-155 抑制剂或miR-155，可以调节单层血管内皮电阻和通透性，转染miR-155 抑制剂组可以显著提高Claudin-1、ZO-1 等紧密连接蛋白水平，而转染miR-155 组则可以降低上述紧密蛋白表达[11]。除了体外研究，在体研究也得到近似结果。给大脑中动脉远端梗阻（dMCAO）的脑梗塞小鼠经静脉注射miR-155 抑制剂，可以显著提高缺血损伤区边沿血流灌注以及微循环血管的完整性，电镜检测观察到注射miR-155 抑制剂的小鼠在脑梗塞后毛细血管的紧密破坏减少，头颅核磁检测发现脑梗塞损伤区体积也较对照组显著减少。进一步研究发现，miR-155 通过调控其靶蛋白Rheb 稳定了紧密连接相关蛋白ZO-1，从而发挥保护血脑屏障的作用[12]。miR-210 也可以负性调控血脑屏障完整性，经侧脑室注射miR-210 导致脑水肿以及IgG 蛋白向脑实质渗透。机制研究发现，miR-210 可以结合在闭合蛋白以及β连环素（β-catenin）mRNA的3'UTR端，降低上述蛋白表达水平，而抑制miR-210 则起到保护性作用[13]。除了影响紧密连接相关蛋白，miRNA也可以通过调节细胞线粒体能量供应影响血脑屏障完整性。例如miR-34a 可以减少线粒体氧化磷酸化和三磷酸腺苷的产生，在血管内皮细胞过表达miR-34a 可以抑制线粒体功能、影响紧密连接蛋白分布、增加血脑屏障通透性[14]。类似miR-155、miR-210、miR-34a、miR-143[15]、miR-150[16]也对血脑屏障的通透性产生负性调控，这也提示抑制负性miRNA有可能成为保护血脑屏障的治疗方法。

然而，也有一些miRNA可以通过多种机制维持血脑屏障完整性。例如，在缺血性脑卒中后血液中及脑组织中miR-132表达水平发生变化，给大脑中动脉栓塞（MCAO）小鼠经侧脑室注射miR-132 可以显著减轻脑梗塞损伤、改善神经功能预后。进一步机制分析提示，miR-132 可以通过抑制其靶蛋白MMP9 减少紧密连接蛋白VE-钙黏着蛋白及β连环素的降解[17]。与之相似，miR-539在脑缺血再灌注模型中表达量降低，而其靶蛋白MMP-9表达含量增高导致血脑屏障破坏。在体外培养内皮细胞并制作氧糖剥夺模型，通过添加外源性miR-593 可以显著改善氧糖剥夺导致的内皮损伤[18]。miR-21 不仅在脑外伤动物模型中被检测到促进内皮细胞紧密连接、稳定血脑屏障[19-20]，还有报道miR-21 可以通过结合MAP2K3的3'UTR 降低脑梗塞后血脑屏障通透性、减少损伤区体积、减轻水肿并改善神经功能[21]。

3.2 miRNA与出血性脑卒中

尽管出血性脑卒中的发病率低于缺血性脑卒中，但出血性脑卒中患者脑血管破裂导致血液进入脑实质，可以引起显著的脑肿胀、颅高压、神经功能障碍，出血性脑卒中的死亡率、致残率往往较高，研究其神经保护策略有重要的临床意义。既往研究报道，脑出血患者血浆中miR-126、miR-146a和miR-let-7a 等miRNAs表达水平降低，其中miR-126表达水平与预后情况负相关[22]。miR-126 有2种成熟剪切形式，分别为miR-126-3p和miR-126-5p。miR-126-3p 可以通过负性调控PIK3R2 影响血管生成及血管内皮完整性[23-24]。在脑出血大鼠模型中，经侧脑室定位补充外源性miR-126-3p 可以减轻脑水肿，抑制炎症细胞浸润以及小胶质细胞激活[22]。miR-132 不仅在缺血性脑卒中过程中对血脑屏障有保护作用，有研究发现其在出血性脑卒中中同样有保护效力[25]。该研究采用自体血脑出血模型，用慢病毒表达miR-132 并定位注射到尾状核，结果发现与对照组相比，外源性表达miR-132 使炎性因子表达水平降低，神经细胞死亡减少，紧密连接蛋白表达水平升高，神经功能得以改善。miR-27a-3p 则是通过直接调节AQP11 影响脑血管内皮细胞通透性。AQP11 是水通道蛋白家族的一员，尽管相较于表达丰度都较高的AQP4和AQP1，AQP11的表达丰度较低，但AQP11 可以同时调节水和糖在血液-脑组织中的转运[26]。脑出血后miR-27a-3p 水平降低，导致AQP11 异常上调，从而影响血脑屏障正常通透转运。

综上所述，miRNA作为表观基因修饰的重要组成部分，在脑卒中后血脑屏障损伤过程中起重要的调控作用，为治疗干预提供了多重靶点[27]。采用具有较高载药量、良好生物相容性、主动靶向性、低毒性的递送方式，外源性补充保护性miRNA，可以保护血管内皮形态，减少紧密连接破坏，维持血脑屏障通透性及物质转运，减少脑组织损伤体积，改善脑卒中后神经功能恢复[28]。因此，进一步探讨如何安全、高效地外源性补充保护性miRNA、抑制损伤性miRNA有长远的临床意义。