浮游植物叶绿素a测定方法研究进展

杨 琳

(池州市环境保护监测站，安徽 池州 247000)

1 前 言

叶绿素a是水生态调查中必不可少的调查项目，是反映浮游植物生物量乃至水体富营养化程度的最直接有效的指标[1]。浮游植物长期以来就被用作水质的生物指标，特别对湖库而言，测定浮游植物的物种和数量，对水质评价有着更为重要的实用意义，而叶绿素a是现场观测中必不可少的测量参数[2]。目前，浮游植物叶绿素a的监测方法主要有分光光度法、荧光法、色谱法，其中传统的分光光度法因所需仪器价格较低、操作简单、测定结果稳定，因此应用最为广泛。不过，由于不同研究对于叶绿素a测定要求时限和精度要求不同，采用研究方法也有所差异，此外，由于当前研究方法众多，往往给研究者在方法选择方面带来困惑，因此，本文将重点对浮游植物叶绿素a监测方法进行综述以为今后相关研究工作提供借鉴和参考。

2 国内外研究进展

目前，国内外叶绿素a测定方法主要有分光光度法、荧光法、高效液相色谱法以及遥感影像法等。现对各种方法综述如下。

2.1 分光光度法

叶绿素a的最大吸收峰位于663nm，根据Lambert Beer 定律，在一定浓度的范围内，叶绿素a吸光度值与其浓度成正比。水样经过滤浓缩、提取、定容后，在最大吸收波长下进行测定其吸光度值，去除干扰值，再根据叶绿素a 的标准曲线就能计算出叶绿素a 的浓度。目前，测定叶绿素一般较多采用分光光度法来进行准确的定量，分光光度法是基于物质分子对光具有选择吸收的特性而建立起来的分析方法，属于光度法的一种[3]。国内水体浮游植物叶绿素测定方法常用的是《水和废水监测分析方法》(第四版)[4]推荐的分光光度法。

1999年，汪志国等用双波长分光光度法同时测定叶绿素a，该法不进行预分离，操作简便，结果与先分离、再以强氧化剂消解后分别测定镁离子浓度进而推算叶绿素a浓度，与原子吸收法具有较好的相关关系[5]。

2005年，韩桂春等[6]对叶绿素测定的国标法、金相灿和屠清瑛主编的《湖泊富营养化调查规范》(第二版)中叶绿素a 测定方法与改进后的第二种方法进行了比较。比较而言，前两种方法样品处理方法繁琐，研磨使用的丙酮有毒，研磨样品转移的时候会造成损失。第二种方法的加酸量不容易掌握，并且酸化后还需稳定 15min，不适宜进行大批量监测。论文提出将滤膜直接放入带塞的试管中，加入10 mL 90%丙酮直接浸提。这种方法叶绿素a 浸提完全没有损失，而且具有操作简便、准确等种种优点。

2008年，冯菁等采用8种不同方法提取微囊藻样品，并且对提取液分别采用三色法、单色法测定吸光度，结果显示单色法的变异系数普遍稍大于三色法，即从方法的稳定性来说，三色法稍优于单色法；从方法的适用范围来讲，三色法基本上适用于各种溶剂，而单色法仅适用于丙酮提取液。另外，从方法的简便性来说，三色法操作简单，产生误差几率小，耗时比单色法短。因此，Chl-a的测定可以根据实际情况的要求选取[7]。

2012 年，童桂凤等[8]将《水和废水监测分析方法》(第四版)和 ISO 10260∶1992(E)中测定叶绿素 a 的典型方法作了比较，比较结果表明，两种方法的测定结果不仅存在显著性的差异，而且具有一定的相关性，他们从提取方法、提取溶剂和计算公式等方面讨论了原因，指出ISO方法提取效率更高，操作更简便。

2017年，李会玲等对《水和废水监测分析方法》(第四版)[4]书中叶绿素a测定方法进行了简化改进，提高了叶绿素a的提取率和稳定性，确保了实验结果的准确度[9]。

现行的分光光度法按照提取剂不同主要分为丙酮法、乙醇法等，其中，丙酮法由于丙酮毒性较大，目前使用较少，乙醇法使用逐渐增多。按照测定方法不同分为单色法和三色法。分光光度法作为浮游植物叶绿素a常规测定方法，多应用于科研工作和环保地表水例行监测，适合室内大批量水环境样品测定。为提高该方法测定准确度，分光光度法可以从以下几个方面进行完善：改变细胞破碎的方式，如超声波、反复融冻；选择更好的萃取试剂，如混合试剂；优化提取方法，如延时或加热提取；选择更优质的滤膜，如玻璃纤维滤膜，冷冻避光保存等。

2.2 荧光法

荧光现象是指物质在吸收波长比较短并且其能量较高的光以后，把光能转换成可见光，即波长比较长的光的现象叫做荧光现象。由于检测的荧光物质有所不同，所以吸收光谱也就不同，荧光的光谱特性因而也有所不同。因此，可以根据荧光光谱的特点来区分荧光物质的性质[3]。当叶绿素a的分子吸收了光量子，这样就得到能量，之后便从基态跃迁到了激发态，跃迁到激发态便产生荧光，再用荧光光度计来测量植物体内所含叶绿素a的荧光强度，进而确定叶绿素a的含量[10-11]。

国外应用荧光法测定浮游植物叶绿素a起步较早，并且在实际应用中取得了大量的实践经验。

1973年，H.H.Kim首次利用机载激光荧光计实现了海藻浓度及其分布的原位测量。该系统采用脉冲燃料激光器作为激发光源，通过测量海水表层叶绿素a所发出的荧光强度，获得有关海藻分布的信息，能够探测到mg/m3量级的叶绿素a含量。之后，基于激光诱导荧光和Raman散射机理的机载和船载激光雷达遥测系统引起了人们极大兴趣，后续出现了大量相关研究报道[12]。

1979年，Yentsch首次提出采用光谱荧光信号探测藻类群落结构，但是荧光法结果不够稳定，虽然通过用DCMU处理浮游植物分子能部分抑制荧光的变化，但很难自动地分析藻类群落的结构。此后，荧光法更多的应用于单一藻类培养物的测定分析和的监测[12]。

1994年，Kaitala 等发现辅助色素与叶绿素的荧光比值不随生长时期的变化而变化，可以通过“选择激发浮游植物色素”来分析浮游植物群落的色素组成[13]。先在实验室建立重要浮游藻纯种的光谱特征分类方法，通过天然水体光谱与纯种光谱基本特征的比较分析，继而得到天然水体色素组成，进一步对浮游藻分类。只能对实验室中已经建立纯种藻类光谱特性的藻种进行区分局限性大，需要消耗大量的人力和物力。

1995年，Lee等发现蓝藻可以敏感而有选择性地从混合浮游植物中检测通过藻蓝蛋白，激发波长620 nm和叶绿素激发波长440 nm，前者用于检测自身的蓝细菌，后者是为减去真核藻类存在于样品中的干涉[14]。根据蓝藻所具有的藻蓝蛋白发出的特征荧光谱，建立了现场活体监测蓝藻叶绿素质量浓度的荧光分析技术，在 0.01～10μg/mL的范围内可准确测定海水样品的蓝藻叶绿素质量浓度。研究了淡水中蓝藻进行了定性和定量的分析，用叶绿素的浓度值来反映蓝藻的生物量，并不能真正意义上说明蓝藻的数量。

1997年，D. Mckee等报道了一种新型的能同时测量叶绿素荧光、光线衰减及大角度散射的组合式仪器[15]。

该仪器包括三个光学传感器(荧光计、浊度计和浑浊度仪)以及配套子系统包括微处理单元、数据存储单元和能量供给单元，并且全部密封在不锈钢管壳内，能潜入水中工作。三个光学传感器共用一个脉冲氙灯作光源。在苏格兰西海岸进行的现场试验表明，该组合仪器具有良好的线性关系、较高的分辨率和较大的动态范围。

2002年，M.Beutler等人研制出了多波长激发荧光的叶绿素浓度现场测量仪，整个仪器置于放入水中的圆筒内，能在几秒钟的时间内对种藻类叶绿素浓度分别进行测量，并把测量结果与测得的结果进行比较,实验证明这种方法是有效的[16]。

国内应用荧光法对水体浮游植物进行监测的研究始于80年代末[17]。国家海洋局第二海洋研究所于1989年应用荧光高度成像光谱仪测的叶绿素 a 浓度值与现场船测结果以及美国空间中心的机载海洋激光雷达所测结果具有良好的相关关系[18]。

1996年，中国科学院海洋研究所报道了一种适用于各种船只的海水叶绿素含量走航自动测定系统[19]。其设计方案是：用水泵从船底连续汲取海水，现场海水连续和稳定地进入荧光光度计样品室，测定海水中浮游植物活体细胞的荧光强度，测定结果经模数转换由主计算机记录。

1998年，燕山大学的王玉田教授团队基于叶绿素a的荧光特性，论证了海藻叶绿素a与海藻浓度之间的相关性，用于海藻生物量测量[20]。

2004年，唐尧基等[21]用N,N-二甲基甲酰胺作为萃取剂，利用荧光法激发与发射波长之差为 237nm，建立了同步荧光法测定海水中叶绿素 a 含量的新方法。该方法具有快速、灵敏及其他常见色素不干扰测定的优点。同年，J. Gregor等[22]对标准 ISO叶绿素 a 定量方法、荧光光谱测定法和水下荧光探针在现场对浮游植物进行定量测定的方法在淡水环境中的性能进行了比较。实验发现水下荧光探针灵敏高效，适合现场测定。

2012 年，马永山等[23]建立了对叶绿素 a 的导数同步荧光检测法。这种方法简便快速，而且并不需要进行复杂的前处理。因此得出，叶绿素 a 的线性范围是0.02～125μg/L，其检出限是 0.25μg/L，其回收率是 97.0%～103.8%。同年，董大圣等[24]研究了叶绿素 a 和浊度传感器技术及其设计。该传感器技术基于荧光诱导的叶绿素 a检测原理和散射的浊度检测技术原理进行设计，可以实时测量海水的相关参数，实现设计所要求的微弱光信号检测功能。

荧光法具有测定速度快、灵敏度高、实时性较好，不受其它常用色素干扰等优点, 多应用于现场测定，或者是在线监测，特别是水体的富营养化测定，可以随时且及时的监测水体中浮游植物的生长分布以及其变化的状态[3]。这一测定方法现行主要有普通荧光测定和同步荧光测定。可以进一步研发快速、准确的现场荧光仪，确定最佳测定条件，丰富地表水原位测定手段。

2.3 色谱法

色谱法的原理是被分离物质在流动相和固定相中的吸附力不同，当样品通过色谱柱的时候，被分离物质在流动相和固定相中不断地发生吸附、解吸，造成组分通过色谱柱的时间不同，不同的物质会先后流出色谱柱，进入到检测器中进行分析，从而达到分离的目的[3]。

在20世纪70、80年代薄层色谱分析发展的较为迅速，这使浮游植物的标志色素可轻易分离，但是由于此项技术专业性太强、效率较低而没有被广泛应用。Mantoura[25]、Suzuki和Wright[26]等很多学者相继建立了分析海洋浮游植物光合色素组成的高效液相色谱法。

2005 年，林少君等[11]对比了叶绿素 a 提取的反复冻融-浸提法与标准方法中的研磨法，证实反复冻融法有稳定性好、人为误差小、结果准确和操作简单安全等优点，非常适合运用于常规的水质监测。

2009 年，侯燕松等[27]学者采用反相高效液相色谱技术(RP2HPLC)系统的研究了我国主要的淡水藻类的光合色素，在8 种纯培养藻类中共确定类胡萝卜素、叶绿素及其衍生物 19 种。通过实际的监测，证实了此项技术应用的可行性，为基于HPLC分析技术的浮游植物化学分类法提供了重要理论依据。

2010年，程红艳等[28]研发使用超声波辅助快速提取 RP-HPLC测定浒苔中叶绿素 a 和 b 含量的方法, 样品前处理简便易操作、提取效率高; 在选定的色谱条件下, 叶绿素 a 和 b 分离度高, 方法重复性好、回收率高, 可作为浒苔中叶绿素 a 和 b 含量快速测定的有效方法。

色谱法弥补了分光光度法无法区分各种色素混合体的缺陷，尤其在湖泊(水库)营养状态分级测定时，可作为分光光度法的有力补充。这一测定方法现行主要有高效色谱法(HPLC)和反向高效色谱法，具有柱效高、分析速度快、精确程度高的特点。为完善该测定方法，今后需进一步优化色谱条件的选择，探索不同光合因子在不同实验体系下的变化趋势，了解更具体的光谱特征，建立完善的实验体系，总结常见光合色素的保留时间、吸收光谱、校正及影响因子等参数。

2.4 遥感影像法

水质遥感技术研究是定量遥感技术研究的一个重要领域。水体中的叶绿素a含量的遥感监测大多通过对水体反射光谱的特征与叶绿素a的浓度之间的关系进行分析从而建立一个数学模型，然后应用到遥感图像上再进行反演，进而对大面积水域的叶绿素a的浓度进行定量估算[3]。目前，水质遥感反演模型构建的方法主要有三种：分析方法、经验方法和半经验方法。其中，主要方法是基于传统统计回归模型的经验方法。

1989 年，国家海洋局第二海洋研究所根据具有不同叶绿素浓度的水体在蓝绿谱段所辐射的光谱特征有所不同，通过采用比值法来监测海面叶绿素的浓度以及分布情况[29]。

2009 年，刘建萍等[30]人选取神经网络法及遥感指数法两种反演方法，来建立叶绿素 a 与 MODIS波段之间的函数关系，并且从反演精度和反演能力两个角度对两种方法分别进行了研究比较。

2012 年，韦玉春等[31]提出使用线性基线校正方法来削弱水体光谱中悬浮泥沙的贡献。根据浑浊水体中悬浮物的光学性质确定的光谱线性基线校正可以较好的提高叶绿素 a 浓度的反演精度，改进反演模型的诊断性。

2018年，夏晓芸等[32]本文利用实时遥感影像数据与实测数据建立了适用于反演大伙房水库叶绿素a的线性回归模型和最小二乘支持向量机模型。由于水体结构复杂，影响水质参数光学性质的因素较多，非线性的最小二乘支持向量机模型的反演精度明显高于简单的线性回归模型。

2018年，张明慧等[33]结合MODIS遥感影像及浮标实测数据，采用“时间连续弥补空间稀疏”的建模策略，通过RF方法构建合理的Chl-a浓度反演模型，使用均方根误差(RMSE)、平均绝对百分比误差(MAPE)和决定系数(R2)进行精度评价，并与传统的BR模型进行对比。结果表明，RF反演模型稳定可靠、精度较高，可弥补传统水质监测无法提供空间连续、宏观、大范围参量信息分布的局限性。该研究提出了基于机器学习的MODIS时序Chl-a浓度遥感反演方法，可为福建近岸水环境连续、大范围监测提供技术支持。

遥感法具有综合、客观、便捷的特点，适用于大面积水体或者海洋水体的长期动态监测，满足预测预警的现实需求。可以实现对水华和水体富营养化的监测及评价，实现区域尺度甚至全球尺度上对水体表层水质参数的时空动态变化进行监测。接下来，可以进一步研究如何克服气象、水文等制约因素，研发高时间、高空间、高光谱的卫星传感器，优化大气校正算法以及现场测量和反演算法。

3 结 论

随着社会的快速发展，水华蓝藻问题越来越突出，成为威胁河海湖库生态环境的关键要素。叶绿素a监测作为评价河海湖库富营养化水平及水生态健康的重要指标，其监测方式目前越来越受到环境监管部门及相关科研机构的重视。虽然目前已有多种监测方式应用于实践，不过每一种监测方法都存在一定的限制条件。因此，环保部门进行例行监测或者科研机构进行长期跟踪监测时要根据监测对象的不同选择合适的方法，甚至选择几种监测方法结合的方式来进行叶绿素a的测定，以为水环境管理和科研工作提供可靠的数据支撑。