丁香假单胞杆菌Avr基因与寄主植物R基因的互作研究进展

黄 喆, 周 静, 潘素君, 刘 敬, 戴良英, 李 魏*

1.湖南农业大学植物保护学院, 长沙 410128;2.娄底职业技术学院农林工程学院, 湖南 娄底 417000

植物借助先天免疫反应和受侵染部位产生的系统信号抵御病原微生物的入侵。植物先天免疫系统可分为两大类，一类是由病原物相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern, PAMP)诱导的免疫反应 (PAMP-triggered immunity，PTI)，它构成植物体内免疫反应的第一道防线。另一类是由病原菌效应因子(effector) 激发的免疫反应 (effector-triggered immunity，ETI)，为植物免疫反应的第二道防线。在ETI反应中，效应因子是病原菌为了能够成功侵染植物，克服寄主细胞自身免疫系统的识别而产生。然而效应因子扮演着双重角色，既是抗性抑制因子又是抗性诱导因子[1]。丁香假单胞杆菌(Pseudomonassyringae)属革兰氏阴性菌，是为害十分广泛的植物病原细菌，它可以感染植物的地上部分，使植物出现叶斑病、叶片坏死、溃疡病等疾病[2]。根据该菌侵染寄主植物方式的不同以及所致病害的不同特征，可将丁香假单胞杆菌大约分为64个致病变种，每个致病变种中都有多个效应因子[3]。随着分子生物学的高速发展，效应因子已成为当前生物学研究的热门领域之一。本文主要介绍了丁香假单胞杆菌效应因子在植物体内致病和诱导抗性的分子机制，以期对植物抗病机理研究、植物病害防治以及农作物抗性基因与种质资源挖掘、抗病遗传育种等领域提供参考信息和策略。

1 效应因子的分类

最初，人们把病原菌效应因子理解为一类能够改变寄主结构与功能的蛋白[4]。因此，效应因子又被称为效应蛋白[5]。效应因子根据其介导的病原物-寄主植物亲和或者不亲和互作可分为毒性(Vir)效应因子和无毒(Avr)效应因子。

1.1 丁香假单胞杆菌TTSS系统

病原菌一旦进入寄主细胞间隙，则主要通过分泌系统向宿主细胞内传递效应因子[6,7]。植物病原细菌在寄主植物体内的生存方式有赖于其自身分泌的效应因子。目前已发现细菌效应因子的分泌系统共有6类(I～VI)[8,9]。细菌通过寄主植物的自然孔口(例如气孔)或伤口进入植物并在细胞间隙中增殖，其中一个主要的发病机制是由III型分泌系统(type three secretion system, TTSS)所介导的[10～12]。研究发现植物病原菌的TTSS具有向寄主细胞注射致病性因子、输出Harpins、运输效应蛋白的功能[13,14]。因此，TTSS是丁香假单胞杆菌侵染过程中重要的蛋白分泌系统，其由hrp基因编码[15]。Jin等[16]和Li等[17]研究表明，丁香假单胞杆菌的TTSS系统具有较长的菌毛，该菌毛能够引导效应蛋白通过植物细胞壁和植物细胞膜或者通过植物质膜。通过该系统，病原菌效应蛋白被直接注入宿主细胞中，对寄主的防御机制起到抑制作用，从而使病原菌在寄主体内得以进一步繁殖和侵染[18,19]。许多丁香假单胞杆菌的III型效应因子(type III effectors, T3Es)是调控植物与病原微生物相互作用的关键性因子[20]。这些T3Es中很多具有不同酶活性，包括半胱氨酸蛋白酶(如AvrPphB和AvrRpt2)、单-ADP-核糖基转移酶(HopU1和HopF2)、磷酸苏氨酸裂解酶(HopAI1)、E3泛素连接酶(AvrPtoB)和蛋白酪氨酸磷酸酶(HopAO1)等[21,22]，利用这些酶调控寄主植物体内的一系列抗病与感病反应。虽然TTSS的注射和运输机制仍在探究和摸索之中，但人们已经普遍接受它是植物病原细菌致病和诱导过敏反应过程中所必须的蛋白分泌系统。

1.2 丁香假单胞杆菌毒性效应因子

毒性效应因子，如丁香假单胞杆菌的VirPphA、 HopAI1、 HopM1、HopU1、HopF2等，能以不同的方式破坏植物的免疫系统，它们介导丁香假单胞杆菌与寄主植物间的亲和作用[21,23～25]。VirPphA是P.syringaepv.phaseolicola中最早鉴定出具有毒性功能的效应因子[23]，它可以抑制其他效应因子激发宿主产生过敏反应，促进病原微生物加速对宿主的侵染。RIN4是HopF2的主要毒力靶标，HopF2可以通过靶向拟南芥RIN4蛋白以促进丁香假单胞杆菌的毒力，另外HopF2也可以在拟南芥体内与寄主AtMKK5蛋白互作，从而抑制寄主的PTI反应[24,26]。2014年，Block等[27]研究表明丁香假单胞杆菌番茄变种 DC3000的毒性效应因子HopD1通过定位于内质网与宿主膜结合转录因子NTL9相互作用来抑制植物的ETI反应。另外，丁香假单胞杆菌效应因子HopAF1、HopB1和HopG1等毒性效应因子可通过阻断乙烯诱导、特异性地破坏免疫受体BAK1以及促进宿主转录抑制因子降解等方式抑制植物的天然免疫系统[28～31]。总之，近年的研究表明丁香假单胞杆菌可以进化出不同的毒性效应因子，以不同的方式干扰或破坏植物的免疫系统，进而侵染宿主细胞。

1.3 丁香假单胞杆菌无毒效应因子

病原物产生的毒性效应因子能够抑制寄主植物的PTI反应，为克服毒性效应因子的这种抑制作用，植物随之进化出相应的R蛋白感知病原物分泌的效应因子，激活过敏反应(hypersensitive response, HR)，即ETI。此时的效应因子被称之为无毒(Avr)效应因子。病原物Avr基因与植物R基因之间的特异性识别与互作是植物实现抗病性的关键。第一个克隆到的Avr基因是来源于丁香假单胞杆菌(Pseudomonassyringaepv.glycinea)的avrA基因[32,33]。另外，丁香假单胞杆菌中的Avr基因，如AvrPphB、AvrPto、AvrPtoB、AvrRpm1、AvrRpt2等介导丁香假单胞杆菌与寄主植物间的不亲和作用也被人们深入研究。病原物Avr基因进入寄主细胞后，往往会对寄主细胞内的靶标蛋白进行修饰或化学催化，而这种修饰或者化学催化作用会被寄主体内的R蛋白识别进而引起HR。如丁香假单胞杆菌的Avr效应因子AvrRpt2能够剪切植物蛋白RIN4，从而激活寄主植物体内的R蛋白RPS2，进而启动基因对基因的抗性[34～36]。而丁香假单胞杆菌的AvrB和AvrRpm1则磷酸化RIN4，被磷酸化修饰的RIN4被寄主植物体内的R蛋白RPM1感应后即激发HR反应[37]。

有意思的是，病原微生物的毒性效应因子与无毒效应因子介导亲和作用还是不亲和作用并不是绝对的，而是由寄主体内有无相应的R基因决定的。当无毒效应因子对应的寄主体内的R基因缺失或者丧失功能时，无毒效应因子就会变为毒性效应因子，介导亲和作用[38]。如丁香假单胞杆菌效应因子AvrRptoB能与番茄抗性基因Pto互作引发HR反应，但在缺失Pto的植物中，AvrRptoB便会抑制寄主植物的程序性坏死反应，促进细菌的生长[39,40]。再如丁香假单胞杆菌III型效应因子AvrRpm1和AvrRpt2在没有抗性蛋白RPM1和RPS2的情况下通过靶向F-box蛋白COI1依赖性信号传导途径来促进细菌毒力[41]。

2 丁香假单胞杆菌效应因子与寄主植物R基因的互作方式

目前，关于丁香假单胞杆菌Avr效应因子和寄主植物体内的R基因的识别方式主要有2种假说，一是直接识别模式，另一种是间接识别模式。

2.1 直接识别模式

直接识别模式又称受体-配体模型。早期，Harold Flor从遗传学角度提出了“基因对基因”假说，并且表征了数十种R-Avr基因组合[1,42]。该假说简而言之就是寄主植物通过其体内的R基因产物直接识别对应的病原微生物的无毒效应因子，进而产生强烈的抗病反应即HR。例如，丁香假单胞杆菌分泌的无毒效应蛋白AvrPto与寄主植物的R蛋白Pto产生直接物理互作进而激发Pto介导的HR[43]。然而，就现有的研究结果来看，人们对于之前被认为是直接识别关系的R-Avr组合又有了新的见解，并且对于许多R-Avr组合，其物理上的相互作用尚未被观察到，所以这种R-Avr直接识别的方式并不多见。

2.2 间接识别模式

近年来，有大量报道指出植物许多R蛋白与病原物Avr蛋白之间并不发生直接的物理互作，而是通过一种间接的方式进行识别。目前，间接识别模式最常见的有警戒模式 (guard model) 和诱饵模式 (decoy model)两种。

2.2.1警戒模式 警戒模式即病原物效应因子与寄主植物体内的靶标蛋白(中间蛋白)识别后，对该靶标进行剪切或修饰，R蛋白在监测到中间蛋白的剪切或修饰后被激活，从而触发寄主的ETI。这种情况下，中间蛋白起到病原物入侵警戒的作用，因此该互作方式被称为警戒模式[1,44]。警戒模型最初是为了解释番茄R蛋白Pto和Prf对丁香假单胞杆菌效应因子AvrPto的感知机制[1]。目前有大量研究结果证实了警戒模式，如拟南芥体内的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶PBS1之前一直被认为是R基因，后来有研究证明丁香假单胞杆菌的效应因子AvrPphB本质是半胱氨酸蛋白酶，它首先通过对自己进行剪切激活，再剪切寄主体内的PBS1，寄主体内的R蛋白RPS5在监测到PBS1被剪切后随即被激活，从而诱导了ETI，出现HR反应[45]。再如上文所提及的效应因子AvrRpt2、AvrRpm1及AvrB磷酸化修饰或剪切它们共同的靶标RIN4后，被修饰过的RIN4至少能够被RPS2和RPM1这两种NBS-LRR蛋白监控识别，进而引起HR抗病反应[35]。

警戒模式在一定程度上解释了一个R蛋白如何识别多个效应因子，这样的话，植物就能利用相对较小范围的R基因库抵御广泛多样的病原体[1,46]。但是2005年Chisholm等[47]在其研究报告中指出，效应因子AvrRpt2的靶蛋白并不是专一的，该效应因子不仅能够裂解RIN4，还能裂解其他可能的靶蛋白。但警戒模式并不能解释这一现象，因此，该模式的理论缺陷也在此。

2.2.2诱饵模式 2008年Van和Kamoun[48]基于警戒模式提出了诱饵模式。诱饵是指寄主植物中一种在序列或结构上类似于真正靶蛋白的抗病蛋白。可以理解为寄主植物为了抵抗病原物入侵，进化出与病原物效应因子真正靶蛋白的结构与序列相似的假靶标，该假靶标一旦被效应因子错误识别后，就会激活R基因介导的HR。值得注意的是，在任何情况下，诱饵模式都意味着R蛋白识别的效应物靶标是诱饵(假靶标)，但该模式并不适用于病原物效应因子缺乏对应的R蛋白这一情况[48]。如丁香假单胞杆菌的效应因子AvrPphB可以通过剪切拟南芥体内的类受体激酶BIK1及其同源蛋白PBLs以发挥其致病作用，植物为此进化出与BIK1和PBLs同源的PBS1蛋白，当效应因子AvrPphB错误识别PBS1并切割该蛋白后，立即激活植物体内由RPS5介导的HR反应[49]。又如AvrPto的真正靶标是FLS2和EFR1，植物为避免真正靶标被AvrPto识别，进化出一种类似蛋白激酶，即诱饵蛋白Pto，该蛋白作为中间蛋白竞争性的与效应因子结合，从而引发Prf介导的HR反应[50]。诱饵模式仍有待进一步研究证明，目前尚无具体研究证据对警戒模式和诱饵模式进行确切的划分。因为这两个模式不一定是相互排斥的，当警戒模式演变成诱饵模式时，可能会出现中间阶段。因此，警戒模式的许多预测也适用于诱饵模式。

3 展望

总体而言，研究效应因子是了解植物抗病分子机制的先决条件，也是植物病理学研究的一个热点。植物的抗病性和病原物的致病性并不是恒定不变的，在自然选择的作用下, 病原物为提高它的致病性会不断产生新的致病效应因子用于攻克植物免疫系统，反过来，植物面对病原物的侵染也会不断进化出新的抗病基因以增强它的抗病性来抵御病原物[51]。因此，病原物效应因子与寄主之间的互作是不断进化发展的。目前，虽然人们对这方面的研究日益深入，但仍有许多不清楚的地方，如R基因识别病原微生物效应因子之后是如何激活下游免疫应答的？人们能否设计出广谱识别Avr基因的R基因？这些问题都有待进一步探究和解释。

作为模式菌种，深入了解丁香假单胞杆菌效应因子与寄主的互作分子机制、植物的抗病机制以及病原物的致病机制，将对植物抗病机理研究、植物病害防治等领域做出巨大贡献，同时也有利于挖掘新的抗性基因与抗性种质资源并利用遗传手段培育优良的抗病植物品种。