响应面法优化超声辅助提取代代花总黄酮的工艺及其抗氧化活性研究

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(1.大连民族大学生命科学学院,辽宁大连 116600; 2.生物技术与资源利用教育部重点实验室,辽宁大连 116600; 3.大连理工大学生命科学与技术学院,辽宁大连 116024)

代代花(CitrusaurantiumL.var daidai)隶属芸香科、柑橘属,又名回青橙、玳玳花等。代代花为常绿小乔木,喜温暖湿润的生长环境,原产地为我国浙江省,现我国东南、华北及长江流域中下游地区均有栽培[1]。代代花气香,味微苦,据《浙江中药手册》载:可“调气疏肝,治胸膈及脘宇痞痛”。代代花食用和药用历史悠久,主要用于胸闷、腹痛、积食、少食、痰饮、呕吐。现代化学成分研究表明,代代花含有挥发油、黄酮、生物碱及多糖类成分[2-4]。现代药理研究表明,代代花中黄酮类化合物具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、抗补体和抑制脂肪生成等活性[5-8]。因此,开发一种高效实用的代代花总黄酮提取技术就显得十分必要。

目前,关于代代花挥发油提取的研究较多[9-11],而对黄酮的提取却鲜有研究,刘海林等[12]采用煎煮法对代代花总黄酮的提取进行了研究,传统的提取黄酮的方法还有浸渍法、渗漉法、回流法、索氏提取法等,但是这些方法均存在耗时较长,得率低等缺点[13]。近年来,超声辅助提取技术作为一种新型的提取方法广泛应用于植物中黄酮类化合物的提取[14-16],该技术是利用超声波的机械效应、空化效应和热效应,强化黄酮类物质的溶出,从而达到快速高效提取的目的。与传统的提取技术相比,超声辅助提取技术具有操作简易、得率高、节能环保等优点[17-18]。

因此,本研究采用超声辅助法提取代代花中的总黄酮,以乙醇浓度、提取时间、温度、料液比为考察因素,通过Box-Behnken响应面设计法探究其最佳的提取工艺条件,并对其体外抗氧化活性进行初步研究,以期为代代花的高值化开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

代代花 采购于河北安国中药材批发市场,经黑龙江中医药大学佳木斯学院陈效忠副教授鉴定为代代花CitrusaurantiumL.var daidai的干燥花蕾;芦丁对照品 中国药品生物制品检定所;2,2-二苯基-1-苦基苯肼(DPPH) 美国Sigma公司;硫酸亚铁、水杨酸钠、氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝 天津市科密欧化学试剂有限公司。

UV-2600紫外可见分光光度计 日本Shimadzu公司;KQ-100DB数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;LK-800A中药粉碎机 北京北拓仪器设备有限公司;ME204E分析天平 瑞士Mettler Toledo公司;RV 10旋转蒸发仪 德国IKA公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品预处理 将代代花药材于25 ℃下自然风干至恒重,粉碎,过60目筛,备用。

1.2.2 代代花总黄酮的提取 取1.2.1中处理好的代代花药材粉末10 g,按一定的料液比加入一定浓度的乙醇溶液,然后利用超声波清洗器进行辅助提取(40 kHz,100 W),在一定的提取温度下提取一定的时间。重复提取3次,提取结束后,将提取液过滤,合并,摇匀备用。

1.2.3 单因素优化实验

1.2.3.1 乙醇浓度对代代花黄酮得率的影响 精确称量10 g 代代花药材粉末6份,分别加入30%、40%、50%、60%、70%、80%乙醇溶液(v/v),控制液料比为20∶1 (g/mL)、超声提取时间为30 min、提取温度为55 ℃、提取3次,合并、过滤提取液,计算代代花黄酮的得率。

1.2.3.2 液料比对代代花黄酮得率的影响 精确称量10 g代代花药材粉末6份,加入不同体积的60%乙醇溶液(v/v),使液料比分别为5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1 (mL/g),并控制超声提取时间为30 min、提取温度为55 ℃、提取3次,合并过滤提取液,并计算代代花黄酮的得率。

1.2.3.3 提取时间对代代花黄酮得率的影响 精确称量10 g代代花药材粉末6份,加入20倍(g/mL)量的60%乙醇溶液(v/v),并控制提取温度为55 ℃,分别每次提取10、20、30、40、50、60 min,提取3次,合并过滤提取液,并计算代代花黄酮的得率。

1.2.3.4 提取温度对代代花黄酮得率的影响 精确称量10 g代代花药材粉末6份,加入20倍(g/mL)量的60%乙醇溶液(v/v),并控制超声提取时间为30 min,分别于25、35、45、55、65、75 ℃条件下提取,提取3次,合并过滤提取液,并计算代代花黄酮的得率。

1.2.4 响应面优化试验 根据单因素试验得出的最佳提取条件:乙醇浓度60(v/v),液料比20∶1 (mL/g),提取时间30 min,提取温度55 ℃,控制提取次数为3次,根据Box-Behnken组合设计原理,以总黄酮的得率为响应值(Y),对四个影响得率的主要因素:乙醇浓度(A)、料液比(B)、提取时间(C)、提取温度(D)分别设定三个水平,并分别编码为-1、0、1,进行试验设计优化。响应面试验因素与水平见表1。

表1 响应面试验因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments

1.2.5 总黄酮含量的测定 精确称量芦丁标准品10 mg,用30%乙醇溶液(v/v)定容至100 mL。分别取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL标准液于10 mL容量瓶中,再加入0.3 mL的5% NaNO2溶液(w/v),摇匀,静置6 min后,加入0.3 mL的10% Al(NO3)3溶液(w/v),摇匀,静置6 min后,再加入2.0 mL的4% NaOH溶液(w/v),之后用30%乙醇溶液定容至刻度线,摇匀,静置15 min。以空白试剂作对照,在510 nm处测定溶液的吸光度(A),以芦丁浓度(C)对吸光度进行线性拟合,得回归方程为A=11.0571C-0.0007(R2=0.9998),表明芦丁在浓度范围为10～60 μg/mL内具有良好的线性关系。

代代花总黄酮的得率计算公式如下:

式中:n为稀释倍数,C为测量的总黄酮浓度(μg/mL),V为样品的总体积(mL),W为代代花药材粉末的质量(g)。

1.2.6 抗氧化活性实验

1.2.6.1 DPPH·清除能力 代代花提取物的DPPH·清除能力测试根据Su等报道的方法[19],并略有改动。将1.5 mL的DPPH·(86.2 μmol/L)与1.5 mL不同浓度的提取液(0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mg/mL)混合,摇匀。在室温下静置30 min后,在517 nm处测定反应体系的吸光度,以VC作阳性对照,DPPH·清除率按照下列公式计算:

式中:Aa为含DPPH·与样品溶液吸光度;Ab为只含样品溶液的吸光度;Ac为只含DPPH·溶液吸光度。

1.2.6.2 ·OH清除能力 代代花提取液的·OH清除能力测试根据Wang等报道的方法[20],并略有改动。首先,将0.5 mL的FeSO4(8 mmol/L)、0.8 mL的H2O2(6 mmol/L)与1.5 mL不同浓度的提取液(0.05、0.1、0.2、0.4、0.8和1.0 mg/mL)混合,摇匀后,加入0.2 mL的水杨酸钠溶液(20 mmol/L)启动反应。然后,将反应体系于37 ℃恒温水浴中避光孵育1 h。以VC作阳性对照,在510 nm处测定反应体系的吸光度,·OH清除率按照下列公式计算:

式中:A0、A1、A2分别为加入全部物质、不加入样品、不加入水杨酸钠组的吸光度。

1.3 数据处理

采用Excel 2016软件处理对单因素试验数据进行分析,采用Design-Expert 10软件进行响应面优化试验设计和数据分析。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 乙醇浓度对代代花总黄酮得率的影响 乙醇浓度对代代花总黄酮得率的影响结果见图1,可知在乙醇浓度由30%增至60%时,代代花总黄酮的得率逐渐增大;70%和80%乙醇作为提取液时的总黄酮的得率小于60%乙醇,这可能是因为乙醇浓度过低会导致大量的水溶性杂质溶出,如蛋白质、糖类等;而乙醇浓度过高会导致大量的醇溶性、脂溶性杂质溶出,从而影响黄酮类化合物的溶出,使黄酮类化合物的得率降低[21]。因此,选择60%乙醇作为提取溶剂。

图1 乙醇浓度对代代花总黄酮得率的影响Fig.1 Effect of ethanol concentration on the extraction yield of total flavonoids

2.1.2 液料比对代代花总黄酮得率的影响 液料比对代代花总黄酮得率的影响结果见图2,可知液料比在5∶1～20∶1 mL/g范围内时,代代花总黄酮的得率随提取溶剂的增多而逐渐增大,可能原因是液料比增大时,会有更多的提取溶剂进入代代花的细胞组织,可以使更多的黄酮类物质从代代花中释放出来,从而提高了总黄酮的得率;但液料比增大到20 mL/g后,总黄酮的得率随着提取溶剂量的增大呈现出平衡趋势,这与Xiong等的报道一致[22],同时考虑到提取成本与回收效率,故确定液料比为20∶1 mL/g。

图2 液料比对代代花总黄酮得率的影响Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on extraction yield of total flavonoids

2.1.3 提取时间对代代花总黄酮得率的影响 提取时间对代代花总黄酮得率的影响如图3所示,由图3可知,当提取时间由10 min增至30 min时,代代花总黄酮的得率逐渐增大,此后总黄酮的得率逐渐小幅度减小,可能原因是延长提取时间,可以使更多的黄酮类物质从代代花中溶出,从而使得率增加;当提取时间到达30 min后,总黄酮的得率呈下降趋势,这可能是因为黄酮类物质经长时间的高温浸泡,分子结构遭到破坏,同时伴随着其他杂质的溶出,从而导致得率略微降低[23]。因此,选择提取时间为30 min。

图3 提取时间对代代花总黄酮得率的影响Fig.3 Effect of extraction time on extraction yield of total flavonoids

2.1.4 提取温度对代代花总黄酮得率的影响 提取温度对代代花总黄酮得率的影响结果见图4。由图4可知,当提取温度由25 ℃增至55 ℃时,代代花总黄酮的得率逐渐增大,温度由55 ℃升至75 ℃时,总黄酮的得率逐渐减小,可能原因是升高提取温度会导致黄酮类化合物分子扩散速率加快,从而有利于增大其溶解度;而继续升高提取温度时,黄酮类化合物分子结构遭到破坏,导致得率降低。因此,选择提取温度为55 ℃。

图4 提取温度对代代花总黄酮得率的影响Fig.4 Effect of extraction temperature on extraction yield of total flavonoids

2.2 响应面优化试验结果分析

响应面优化试验设计及结果如表2所示,对试验结果进行分析,得回归方程为:Y=2.55+0.016A+0.067B+0.20C+0.22D-2.5×10-3AB-0.020AC-0.015AD-0.13BC+0.05BD+0.082CD-0.31A2-0.14B2-0.22C2-0.28D2

由方差分析表3可知:四个因素对代代花总黄酮得率的影响从大到小依次为:提取温度(D)、提取时间(C)、液料比(B)、乙醇浓度(A),其中提取温度(D)、提取时间(C)、液料比(B)、液料比(B)与提取时间(C)的交互作用对得率的影响极显著(P<0.001),提取温度(D)与提取时间(C)的交互作用也对得率具有显著影响(P<0.05),此外,模型P<0.0001,表明此回归模型极显著;失拟项P=0.1698>0.05,失拟项不显著,表明不存在失拟因素,此模型的拟合程度较好;AdjR2=0.9636与R2=0.9818接近,表明回归模型可靠。

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Response surface experiment design and results

响应面曲面图可反映出当其中两个变量取零水平时,另外两个变量的交互作用对响应值的影响程度,响应曲面图坡度越陡峭,则表明两因素交互效应对响应值的影响越显著,反之,响应曲面图坡度平缓,说明其交互作效应对响应值的影响不显著。此外,等高线的形状及疏密程度也反映出两因素交互效应的强弱,若等高线密集呈椭圆形,说明其交互效应对响应值的影响显著;若等高线越稀疏呈圆形,则表明其交互效应对响应值的影响不显著。根据以上特征,由图5可知,固定乙醇浓度与液料比,总黄酮得率随着提取温度和提取时间的同时增加呈现先升高后下降的趋势,且提取温度50 ℃和提取时间30 min附近值对总黄酮得率有重要影响,且等高线图呈椭圆形,说明两因素之间的交互效应显著。固定提取时间与提取温度,随着乙醇浓度和液料比的同时增加,总黄酮得率呈现先升高后下降的趋势,且乙醇浓度60%、液料比20 mL/g附近值对总黄酮得率有重要影响,但等高线图椭圆不明显,说明两因素之间的交互效应不显著。固定乙醇浓度与提取温度,液料比较低时,等高线相对密集,说明在液料比低时,提取时间对总黄酮得率的影响显著,增加提取时间可以显著提高总黄酮得率,但当液料比较高时,增加提取时间对总黄酮得率的影响不大。同理,可对其他两因素的交互效应进行分析。

表3 方差分析及显著性检验结果Table 3 Analysis of variance and significance test of the regression model

注:*表示显著(P<0.05);**表示极显著(P<0.001)。

图5 两因素的交互作用对代代花总黄酮得率影响Fig.5 Effects of interaction of two factors on the extraction yield of total flavonoids

2.3 验证试验

采用响应面法优化分析得到最佳工艺条件为:乙醇浓度为59.97%、液料比为20.49∶1、提取温度为59.72 ℃、提取时间为35.11 min,在此条件下预测代代花总黄酮的得率为2.66%。为方便实际操作,确定乙醇浓度为60%,液料比为20 mL/g、超声温度为60 ℃、提取时间35 min,并在此条件下平行试验3次,得到代代花总黄酮的平均得率为2.62%,与预测值的相对误差为1.50%,表明模型可靠,可用于代代花总黄酮的提取。

2.4 抗氧化活性结果分析

2.4.1 DPPH·清除能力分析 代代花总黄酮提取物的DPPH·清除能力结果如图6所示,可知,当代代花总黄酮粗提物浓度范围在0.1～1.0 mg/mL时,对DPPH·清除率随着样品浓度的增加而增大,与抗坏血酸相比,代代花总黄酮提取物对DPPH·的清除能力相对较弱,当抗坏血酸溶液浓度在0.2 mg/mL时,对DPPH·的清除率达90%,其IC50为0.078 mg/mL。当样品浓度为1.0 mg/mL时,对DPPH·的清除率达82.56%以上,其IC50为0.385 mg/mL,说明代代花60%乙醇提物对DPPH·具有一定的清除作用,但是略低于Karimi等[24]报道的代代花甲醇提取物的DPPH·清除能力(IC50为0.30 mg/mL)。

图6 代代花总黄酮粗提物的DPPH·清除能力Fig.6 DPPH· scavenging capacity of crude flavonoids extracts

2.4.2 ·OH清除能力分析 代代花总黄酮粗提物的·OH清除能力如图7所示,当代代花总黄酮粗提物浓度范围在0.05～0.4 mg/mL时,对·OH清除作用随着样品浓度的增加而快速增强,浓度大于0.4 mg/mL后,清除率随样品浓度的增加增幅较缓,当浓度为1.0 mg/mL时,对·OH的清除率达86.25%,其IC50为0.255 mg/mL,而抗坏血酸的IC50为0.069 mg/mL,说明代代花总黄酮粗提物对·OH具有一定的清除作用,据报道,代代花主要的黄酮类成分,如橙皮苷、橙皮素、柚皮苷均具有较强的清除·OH的能力[25-26]。

图7 代代花总黄酮粗提物的·OH清除能力Fig.7 ·OH scavenging capacity of crude flavonoids extracts

3 结论

本研究在单因素试验结果的基础上,采用响应面法优化得到代代花总黄酮的最佳工艺为乙醇浓度60%,液料比20∶1 (mL/g),提取温度60 ℃,提取时间35 min。在此条件下代代花总黄酮的得率为2.62%,与模型预测值2.66%高度相符,说明本实验采用的响应面法优化代代花总黄酮的超声提取工艺,方法可行,具有实用价值。代代花总黄酮粗提物具有较好的DPPH·和·OH清除能力,其IC50分别为0.385和0.255 mg/mL,因此,代代花总黄酮粗提物有望开发为天然抗氧化剂。