大肠菌群主要检测方法研究进展

宁倩倩

(1.江西科技师范大学有机功能分子研究所，江西 南昌 330013；2.江西省有机功能分子重点实验室，江西 南昌 330013)

引 言

公共安全和环境保护需要安全饮用水，这意味着它必须不含致病菌。在水源传播的病原体中，肠道病原体是最常见。因此，人类活动水域中的粪便污染源必须严格控制[1]。为了对水质微生物做出及时性评价，致病菌的快速有效检测就显得尤为重要。传统检测方法(包括分离培养和生化鉴定等)对病原体检测的特异性和灵敏性低、操作繁琐且费时，不能满足现阶段水质评价需求。近些年来，酶底物法由于其自身的一些优势迅速发展起来，已经广泛用于水质微生物评价。

1 酶底物法的研究进展

随着对传统检测方法的进一步研究，发现其存在一些局限性，包括潜伏期长等问题。酶底物法是基于细菌的特定酶活性(例如，β-D-半乳糖苷酶和β-D-葡萄糖醛酸苷酶)检测大肠菌群的一种方法[2]，因为其自身的特异性而广受研究者关注。

2016年，卜晓红[3]使用酶底物法和多管发酵法对大肠菌群进行检测。对比30份样品的总大肠菌群MPN检测结果，通过配对t检验对测试结果进行分析，发现两种方法的检测结果基本相同，差异无统计学意义。同年，蒋玲等[4]在此基础上对于同一受试对象分别接受2种不同处理方法采用配对t检验分析，同样验证了该结论。随后，邓永宏等人[5]分别使用乳糖胆盐发酵法、乳糖蛋白胨发酵法、51孔定量圆盘法、97孔定量圆盘法四种方法检测水样中的大肠菌群含量。结果显示：乳糖胆盐发酵法的阳性检出率为58.8%，乳糖蛋白胨发酵法的检出率为61.8%，酶底物法的检出率为73.3%。结果表明：51孔定量圆盘法相比于多管发酵法的灵敏性更高，但是定量范围比较窄；97孔定量圆盘法的灵敏性和定量范围都比多管发酵法的好。同年，褚福敏等人[6]系统地研究了滤膜法和酶底物法。选取城市供水中不同类别的样品进行肠球菌的检测，以加标纯水和两种水源水为研究对象，开展了3组酶底物法和滤膜法的精密度对比试验，由于肠球菌的含量较低，两种方法的精密度均不是很好，但是，酶底物法的灵敏度明显比滤膜法高。

2017年，刘瑞等[7]使用酶底物法、多管发酵法和快速纸片法这三种方法测定了粪大肠菌群的含量。这些方法的假阴性率和假阳性率都为零。对比这三种方法质控样品的平均值，结果显示三者均在质控样品数量范围内(180 CFU/mL～1 100 CFU/mL)，而相较于质控样品指定值(580 CFU/mL)，酶底物法略高。因此，酶底物法用于中国水环境监测，其评价标准和适用范围尚需大量实验数据加以修正和验证。后来，李斯婷等[8]6位检测人员同时用酶底物法与平皿计数法对生活饮用水水样进行菌落总数对比测试，并对两种方法的检测结果进行了配对t检验，结果显示检测数据存在相关性，且相关程度很高，具有一致性和稳定性。表明酶底物法可以替代平皿计数法。随后，刘玉红等[9]又对比分析了样品处理过程、数据读取方法、标准样品以及实际水样检测数据的准确性和准确性。结果表明：酶底物法样品处理时间只需30 min左右，而且菌落清晰，在紫外灯下分布均匀，标准样品的测量结果在允许误差范围内。平板计数法对标准样品的测量结果同样在允许误差范围内，但是使用平板计数法处理样品需要2 h以上，菌落大小有所不同、分布不均匀。另外，杨晓冉等人[10]在无菌处理室、非无菌实验室以及室外环境中测试了大肠菌群。结果表明，实验环境的无菌性对酶底物法测定水中大肠菌群的影响很小。因此，酶底物法可以很好地弥补传统方法的一些不足，有望替代传统方法在常规监测和应急污染事故中做出快速评价。

2018年，刘宁[11]采用实际水样测试和加标测试方法，通过酶底物法和多管发酵法检测水样中大肠菌群的含量。分析对比了实验数据，发现实验结果基本相同，差异无统计学意义。但是，大多数的多管发酵法使用的都是半成品培养基，经实验室配置后再用于样品检测，需采取一系列的准备工作，任何环节的任何误差都可能会导致测试结果出现偏差。因此，酶底物法可用于大肠菌群的含量测定，可以更好地替代多管发酵法用于评价水中微生物。

2019年，张会强等[12]同时使用多管发酵法、滤膜法、纸片快速法和酶底物法在相同的取样量和培养条件下对水样进行检测，并同时将酶底物法、纸片快速法和滤膜法的检测结果分别与经典的多管发酵法进行了对比分析。从方法的检出限来看，纸片快速法的检出限为20 MPN/L。多管发酵法和酶底物法的最低检出限同为3 MPN/L；滤膜法不受取样量限制，检出限最低。从实验操作来看，多管发酵法和滤膜法都需要培养基的准备和复发酵过程，操作繁琐；然而纸片快速法和酶底物法不需要配制培养基，操作简便。因此，多管发酵法工作量大，耗费时间长；滤膜法操作强度和耗费时间略低于多管发酵法；酶底物法和纸片快速法操作简便，更适合于大量样品的快速测试。从定量菌株检测结果来看，酶底物法的准确性和精密度均优于其他三种方法。从相关性对比来看，多管发酵法与纸片快速法、酶底物法之间无显著差异，而与滤膜法存在显著性差异。

2 酶底物法的优缺点

近些年，酶底物法在评价水质微生物方面起着至关重要的作用，所以急需清楚了解酶底物法在水质微生物检测中的优缺点。本文从实验操作、人员配置、检验成本、灵敏度、精密度等方面对酶底物法进行了综合评价。

2.1 实验操作

多管发酵法需要通过初发酵、镜检、复发酵等一系列试验，步骤多、时间长、操作繁琐，而酶底物法不用配制培养基。

2.2 人员配置

由于基层实验室的人员配备不够，需要节省人力成本，步骤简便的酶底物法特别适合在基层实验室推广应用。

2.3 检验成本

酶底物法虽然成本贵，但是，该方法是通过粪便大肠菌群释放的特异性酶和与其作用的特异性酶底物产生的特异性酶促反应来进行大肠菌群含量测定的，具有快速准确检测的特征，并且实验操作人员不需要很强的专业性，检测周期短，过程简单，较少受人为污染，能够准确判断水样的受污染状况。

2.4 灵敏度、精密度

与传统的多管发酵法相比，酶底物法的假阳性和假阴性率较低，操作简单快速，时间较短，重现性较好，加快了分析速度，提高了工作效率。与滤膜法相比，酶底物法的检验周期以及结果的准确性和灵敏性具有明显的优势。

3 结论

酶底物法在检验周期、设备设施投资等方面较滤膜法有明显优势，酶底物法实验过程中将一次性取样瓶更换为可多次重复使用的玻璃瓶，检验成本有所降低，但是，单次的检验成本仍略高于滤膜法。将酶底物技术与膜技术相结合的酶底物滤膜法，其不需要染色镜检和复发酵的确认测试，只需24 h的培养过程即可计数特征颜色的细菌菌落并获得相应结果，因此，它有助于现场检测大肠菌。目前，酶底物法在国内正逐步开始推广，但是由于该方法的成本较高，还没有被广泛使用。如果将来试剂、耗材价格能有所下降，水样的测定范围能进一步提高，一定会得到更好的推广。