奥沙利铂在消化系统肿瘤中的耐药机制研究

牟雪瑶，汤志明，柳 丹，白 磊，牛成群 综述，李 珊△ 审校

(湖北医药学院：1.基础医学研究所；2.生物工程学院，湖北十堰 442000)

奥沙利铂(左旋反式二氨环己烷草酸铂，oxaplatin,OXA)是铂类化疗药物成员之一。OXA的相对分子质量大，在相对分子质量相同的情况下，所含的分子数目少于顺铂，但是OXA却具有更强的细胞毒效应，推测产生这种效应的原因是由于其特殊的分子构象。OXA的结构与其他铂类药物相比略有差异，铂原子与一个草酸基和1,2-二氨环己烷紧密结合，使OXA能够通过多种损伤机制启动细胞凋亡[1]。OXA结构存在着3种同分异构体，但是它们与DNA的作用方式并不完全一致。OXA进入细胞核后可以结合于DNA上，以DNA链上鸟嘌呤(G)作为其作用靶点，形成多种交链结构(链内、链间交链)，导致DNA复制和RNA转录受损[1]。当OXA引起DNA损伤发生以后，细胞主要采取细胞内核苷酸切除修复来进行修复，而不能修复的损伤将引起细胞凋亡和增殖的平衡遭到破坏。多项研究发现，许多基因的表达水平改变都与OXA在消化道肿瘤中的耐药密切相关，包括多种耐药相关基因：紫杉醇耐药基因1(taxol-resistant gene 1,TXR1)、ABCC1、MRP5、MDR1、LRP1、缺氧诱导因子-1α (hypoxia inducible factor-1,HIF-1 α)；多种非编码RNA KCNQ1OT1、HULC、MALAT1、ENST00000502804、ENST00000518376和小RNA：miR-7-5p、miR-134、miR-200b/c、miR-19b-3p、miR-21、miR-145、miR-503-5p、miR-34a、miR-506、miR-137、miR-137、miR-409-3p等 。而且随着药物的广泛应用，越来越多的消化道肿瘤都表现出OXA的耐药，其机制复杂多样，本文主要将消化系统肿瘤(肝癌、结直肠癌、食管癌和胃癌)中OXA耐药发生的机制进行综述。

1 OXA在肝癌细胞中的耐药机制

1.1肝癌细胞干细胞特性增强导致耐药 在肿瘤组织中存在着多种肿瘤细胞，肿瘤干细胞 (cancer stem cells,CSC) 是在肿瘤组织中出现的极少数既有肿瘤细胞特性又有干细胞特性的细胞，对多种抗肿瘤药物表现出先天性的抵抗能力，与肿瘤细胞的化疗耐受性密切相关。CSC可以通过内在和外在的多种机制导致化疗药物耐受，主要包括：(1)增强DNA损伤修复机制；(2)改变细胞周期；(3)促进药物外排；(4)改变肿瘤的微环境。OXA作为抗肿瘤药物，在治疗诱导肝癌细胞(hepato cellular carcinoma，HCC)的过程中产生的细胞耐药与干细胞的特性密切相关[2]，将OXA处理后产生的CSC细胞注入其他小鼠的肝脏中将导致肝细胞对OXA的敏感性降低，并且这一作用可能与分泌的胰岛素样生长因子1有关。

1.2HCC自噬增加 自噬是真核细胞普遍特有的生命现象，是细胞在多种代谢压力(包括能量缺乏、饥饿等)下，真核细胞发生自我消化并获得存活机会的一种高度保守生物学过程。自噬体能够与溶酶体融合形成自噬溶酶体，利用溶酶体中的酸性环境和多种代谢酶降解胞内受损蛋白质和细胞器，并回收利用。细胞通过自噬，可以及时清除破损细胞器、损坏的蛋白质等有害成分，获得维持细胞生存与生长所必需的能量、核酸、氨基酸和脂肪酸等，并提供应急的底物和能量为修复受损DNA赢得时间和条件[3]。近期的研究显示，自噬是肿瘤细胞在化疗药物作用情况下的一种重要存活机制，通过自噬可以抑制化疗药物引起的凋亡，从而促进肿瘤细胞的存活[4]。DU等[5]研究表明在HCC中加入OXA，可以通过激活细胞自噬，产生明显的自噬小体，进而促进细胞发生耐药。2018年，REN等[6]研究表明miR-125b通过跨膜蛋白166参与细胞自噬从而参与了HCC的OXA耐药。因此得出结论，自噬的发生有可能帮助HCC细胞在OXA的作用下存活下来。在一定程度上抑制自噬的发生，运用特异性的自噬抑制剂可能将提高OXA的疗效并抑制OXA的耐药发生。

1.3参与细胞凋亡或增殖的蛋白表达异常

1.3.1激酶活性异常 双特异性酪氨酸磷酸化激酶 [dual specificity tyrosine-(Y)-phosphorylation-regulated kinases,DYRKs]具有激酶活性，通过调控细胞周期和细胞凋亡参与肿瘤的发生、发展。研究发现，DYRK2可通过多种抑癌基因的作用从而抑制肿瘤细胞增殖，而DYRK2的表达水平降低与肿瘤的化疗效果不佳、预后不良密切相关[7]。2016年，ZHANG等[8]通过分析86例患者的肝癌细胞组织和癌旁组织中DYRK2的表达，发现在恶性程度更高及生存率更低的患者中，DYRK2的表达下调更加明显。近期研究表明，鞘氨醇激酶1(sphingosine kinase 1,SphK1) 的过表达也能够Akt/GSK3β信号途径引起肝癌细胞过度增殖从而诱发OXA耐药的发生[9]。

1.3.2长链非编码RNA 通过基因组计划解析发现，人体中存在着大量的非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)。转录产物大于200 bp的则被称为长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)。研究发现，lncRNA能够通过在转录及转录后水平以及影响基因的甲基化程度调控编码基因的表达，从而参与包括肿瘤在内的多种重大疾病[10-12]。多项研究表明，在多种恶性肿瘤中均发现有lncRNA的异常表达，并且其表达程度与肿瘤的发生和发展密切相关，具有一定的诊断肿瘤发生和判断预后的价值[13-14]。2017年，YIN等[15]通过测序比较OXA耐药HCC细胞系中 lncRNA的表达情况，发现NR_073453、lncRNA ENST00000502804和ENST00000518376的RNA水平明显升高。这一结果提示，lncRNA表达在HCC耐药方面可能也起着重要作用。

1.3.3其他与肿瘤生长相关蛋白 哺乳动物同源盒基因(homeotic gene,HOX) 最早由于在神经系统内的广泛表达而引起人们关注的。但是后来的研究发现，HOX8在人类多种肿瘤中均有过表达，并且与肿瘤的发生、发展紧密相关。2015年，XU等[16]研究证实HOXC8在肝癌组织中过量表达，并且与肝癌患者的组织分级和预后不良密切相关。干扰HOX8的表达将抑制细胞周期，细胞增殖和逆转HCC的OXA耐药的发生；而过表达HOX8的表达将促进HCC的OXA耐药发生。

分泌簇连蛋白(secretory clusterin,sCLU) 表达于晚期肝癌组织中，与组织分级和患者生存率降低密切相关。sCLU在耐药的HCC细胞系中表达升高，抑制sCLU的活性可以增强肝癌细胞对化疗药物的敏感性。sCLU对OXA的药物敏感性与Gadd45a和PI3K/Akt信号通路密切相关[17]。

因此，改变多种与肿瘤生长相关蛋白的表达和功能也可以作为逆转肝癌OXA耐药的重要靶点。

2 OXA在结直肠癌细胞中的耐药机制

结直肠癌细胞耐药发生的机制主要包括以下几个方面：(1)通过细胞膜的运转作用使药物从细胞膜内流出到细胞膜外；(2)阻碍药物流入细胞膜；(3)影响DNA切除修复相关通路及细胞凋亡；(4)调控代谢相关蛋白。

2.1膜转运蛋白过表达 研究发现，在肿瘤细胞膜上有许多转运体蛋白，有一些转运蛋白能够使药物从肿瘤细胞内流出，降低药物在细胞内的蓄积，降低化疗药物的细胞毒效应，进而促进细胞耐药的发生[18]。这些蛋白主要包括：多药耐药基因(multidrug resistance1,MDR1) 编码生成的P-糖蛋白、乳腺癌耐药相关蛋白、多药耐药相关蛋白等。多项研究发现，多种细胞膜转运蛋白在结直肠癌患者OXA耐受的患者中呈现高表达趋势，提示膜转运蛋白可能通过促进药物外排，进而促进OXA的耐药发生[19]。

人铜转运蛋白1 (human copper transporter1,hCTR1) 通过细胞膜内形成三聚体结构进而构成一个锥形的孔道结构来发挥效应。研究表明，hCTR1可以通过结构内的蛋氨酸片段转运多种金属离子，铂类物质也能够通过hCTR1进入到多种肿瘤细胞内[20]。WANG等[21]研究发现，hCTR1在细胞内的表达水平与细胞对OXA的敏感性密切相关，hCTR1表达升高可以促进OXA引起的细胞凋亡发生；相反的，hCTR1表达下降则可以导致OXA引起的细胞凋亡减少，耐药发生。2016年，LI等[22]在HCC细胞中加入OXA，发现其能够显著抑制hCTR1的表达水平，并且具有浓度依赖效应。当干扰hCTR1的表达后，OXA引起的细胞毒效应明显减低，细胞对OXA的耐药性增加；另一方面，使用药物抑制hCTR1的降解可以增强HCC细胞对OXA的敏感性。这些结果均表明OXA通过促进hCTR1的降解，降低hCTR1的表达水平，导致其治疗效果受限；通过抑制hCTR1的降解，能够增强OXA的抗肿瘤效应，抑制OXA的耐药发生。通过比较OXA耐药细胞系与其亲本细胞系中基因表达差异，发现hCTR1、ATP7A、ATP7B、hOCT1和 hOCT2 等多种膜转运蛋白均可能是OXA导致结直肠癌耐药的主要靶位点。

2.2DNA切除修复相关通路及细胞凋亡机制 研究表明，DNA切除修复系统中存在着错配修复或核苷酸剪切修复，而细胞凋亡是一种细胞受到损伤后启动的自我保护的机制，存在于多种肿瘤细胞中。在结直肠肿瘤细胞，OXA进入细胞核后可以结合与DNA上，形成多种交链结构(链内、链间交链)，导致DNA复制和RNA转录受损。当OXA引起DNA损伤发生以后，细胞主要采取细胞内核苷酸切除修复来进行修复[23]，而不能修复的损伤将引起细胞凋亡的产生。因此，DNA切除修复系统的过表达可以清除受损的DNA和过量的药物，帮助肿瘤细胞对OXA产生耐药，而一旦出现凋亡抵抗，也容易诱发结肠癌细胞对OXA的耐药发生[24]。

2.3代谢相关蛋白 葡萄糖调节蛋白78 (glucose-regulated protein 78,GRP78) 是一个内质网压力信号通路调节蛋白并且具有一定的抗凋亡效应。XI等[25]研究发现，在结肠癌细胞HT29中，OXA能够抑制CD24的表达，外源性干扰CD24能够导致结肠癌细胞对OXA的敏感性增加，而外源性过表达CD24能够促进结肠癌细胞OXA的耐药发生。通过免疫共沉淀发现，CD24通过结合GRP78从而发挥调控OXA耐药效应。

当正常细胞损伤出现时，谷胱甘肽-s转移酶 (glutathione S-transferases,GST) 可以起到抗损伤、抗癌变的作用。但近期研究发现，在肿瘤细胞中，GST的表达量也可能与化疗药物的敏感性密切相关[26]。研究发现，在结直肠癌患者中，GST表达水平高的患者较其他患者，对OXA更不敏感，而且预后不良，但其具体作用机制还不明确。

2.4MicroRNA MicroRNAs作为各种癌症治疗药物获得性化疗耐药的主要调节剂，其表达水平变化与化疗耐药有关。miR-145可通过影响MDR1、PTEN的基因和蛋白表达水平调控人结肠癌耐OXA细胞株的药物敏感性[27]。除此之外，miR-492、miR-203也被发现能够通过调控细胞因子和ATM激酶参与结肠癌细胞的OXA耐药。因此，改变microRNAs的表达可影响与OXA耐药相关的重要蛋白的功能，从而能够为结直肠癌的OXA耐药提供新的分子靶标。

3 OXA在食管癌细胞中的耐药机制

3.1miR-141-3P miR-141-3p在食管癌细胞中的表达显著增加，其表达水平与食管癌细胞分化程度和TNM分期有关[28]。磷酸酶和张力蛋白同源物(phosphatase and tensin homology,PTEN)是miR-141-3p的直接靶标。 JIN等[28]研究发现PTEN表达和miR-141-3p表达之间的逆相关性，miR-141-3p通过抑制PTEN的表达水平，在体外和体内研究中均显示有助于食管癌细胞获得化学耐药性。因而推测，抑制miR-141-3p将有利于逆转食管癌的OXA耐药的发生[29]。

3.2肿瘤瘦素(leptin) leptin表达具有作为细胞毒性化疗耐药性的预测标记的潜在效用。在胃食管腺癌中，leptin表达与化疗耐药有关[30]。leptin拮抗剂已经开发用于临床，leptin及其相关途径的关键位点也可能为胃食管腺癌治疗提供急需的新型靶点。

4 OXA在胃癌细胞中的耐药机制

胃癌细胞耐药机制主要与ABC转运蛋白家族包括P-gp、MRP相关。WU等[30]研究表明LnRNA BLACAT1通过结合于miR-361调控P-gp的表达进而参与胃癌细胞的OXA耐药。HU等[31]研究发现转录因子复制叉盒M1蛋白可以结合在髓样白血病1蛋白的启动子上从而引起胃癌细胞的OXA耐药发生。

5 OXA在临床上的应用

由于单药用药后，肿瘤细胞更易出现耐药性存活，目前临床上多推荐使用多药联用的方式提高疗效以降低患者的耐药性，提高患者生存率。2017年美国国立综合癌症网络指南将含有OXA的FOLFOX、CapeOX 方案确立为治疗消化道肿瘤的一线化疗方案。临床首选双药方案主要为氟嘧啶(氟尿嘧啶或卡培他滨)加上OXA。但是多项近期研究显示，在消化系统肿瘤的治疗中，除了氟嘧啶，OXA还可与替吉奥、卡培他滨、多西他赛、紫杉醇脂质体等多种药物联合使用，能够提高化疗药物的效果，减轻不良反应，治疗效果显著[32-33]。2018年，姜洪胜等[34]研究发现，用OXA联合卡培他滨治疗胃癌，能有效的针对RET、C-MET、AXL、VEGFR2基因靶点进行治疗，具有良好的治疗效果。还有一些研究将OXA与多种肿瘤细胞表面受体结合，作为分子靶向药物应用。如利用OXA结合人类表皮生长因子2受体制备成金属纳米化合物，特异性地分子靶向HER2阳性的胃癌细胞[35]，或结合VEGFR2形成免疫脂质体靶向诱导结直肠癌细胞的凋亡[36]。但是对于OXA应用于个体化异质化治疗，目前尚无相关报道。

6 结语与展望

目前已发现的OXA在不同消化系统肿瘤中的耐药机制不同，但是有些机制却普遍存在于多种肿瘤细胞中。由于细胞一旦产生耐药性后，经常表现出对多种化疗药物的耐受，一些多药耐药基因的表达异常及其相关调控机制(MDR1、P-gp、MRP、hCTR、TXR1、ABCC1、LRP1、HIF-1等)仍是研究OXA耐药的主要靶点[37]。近年来，随着研究的不断深入，肿瘤干细胞的发现和肿瘤自噬耐药也逐渐成为OXA耐药研究领域的热点。OXA在肝癌中的耐药机制主要与肿瘤干细胞性增强、自噬增加及与细胞增殖和凋亡相关蛋白的表达异常相关。OXA在结直肠癌中的耐药机制主要集中于膜转运蛋白过表达、切除修复相关通路及细胞凋亡机制改变、代谢相关蛋白表达异常。而OXA在食管癌和胃癌耐药中的机制研究较少，主要涉及一些重要的microRNA的转录调控作用。

综上所述，OXA的耐药机制十分复杂，涉及细胞多个信号通路，很多信号通路之间还有多个交叉点。因此，目前的研究不够全面，只能反映OXA在消化系统肿瘤耐药过程中的部分机制，尤其在胃癌和食管癌的研究中，研究工作不多，能参考借鉴的结果更少。如果能够更全面地揭示OXA在消化系统中的耐药机制，能够大大地提高其在临床上的应用，提高治疗效果，让更多的患者受益。