金枪鱼中生物胺的防控技术与检测技术的研究发展

邓建朝，李少丽,2，杨贤庆*，陈胜军，吴燕燕，李春生，马海霞，荣辉

1(中国水产科学研究院南海水产研究所，农业农村部水产品加工重点实验室，广东 广州， 510300)2(上海海洋大学 食品学院，上海，201306)

金枪鱼又名鲔鱼，吞拿鱼，属鲈形目鲭科，是一种大型远洋性洄游鱼类，生活范围较为广阔，常见于太平洋、大西洋和印度洋等中低纬度深海区[1-2]，在南海外海也存在黄鳍金枪鱼的生活密集区[3]。因其生活环境的特殊性，金枪鱼几乎不受污染，再加上其肉质鲜美，营养丰富，含有大量的DHA和EPA等不饱和脂肪酸[4]，从而深受全球各大消费者的喜爱。据最新国际渔业动态显示,金枪鱼类市场鱼价指数近年来增加了8%，太平洋蓝鳍金枪鱼库存从目前捕捞前水平的2.6%逐步提高,增长了7倍[5]，且消费者需求还在持续上升。

但是食用金枪鱼也存在一定的潜在危险，其中生物胺对人体的影响是目前最受关注的一个研究方面。由于金枪鱼的高蛋白质以及高游离氨基酸的含量[4]，使得金枪鱼在存放过程中极易出现腐败变质的现象，在腐败过程中，蛋白质以及游离氨基酸在氧化作用下会产生大量的生物胺，鱼肉品质受到影响，严重情况下会引起食物中毒，因此对金枪鱼的质量监管就显得尤为重要。

1 生物胺形成机理及功能危害

1.1 生物胺的形成机理

生物胺是具有生物活性的低分子质量有机碱[6]，主要由氨基酸的脱羧或醛和酮的氨基化和转氨作用形成[7]，可根据分子结构分为三大类，一类是脂肪族，如腐胺、尸胺、精胺、亚精胺等；一类是芳香族，如酪胺、苯乙胺等；一类是杂环族，如组胺、色胺等[8]。对生物胺的研究早在19世纪80年代就已经开始，1990年VIDAL-CAROU[9]就对意大利香肠中的生物胺进行了研究，发现从自身检测出的微生物种群与生物胺的生成有关。由于不断出现生物胺食物中毒的现象，尤其是水产品以及水产品相关产品的生物胺中毒，人们逐渐对生物胺的研究重视起来。

1.2 生物胺的功能及危害

生命机体中存在微量的内源性生物胺，而外源性生物胺主要由微生物中的氨基酸脱羧酶对自身的前体氨基酸脱羧而成[10]。微量的生物胺对人体有一定的好处，精胺、亚精胺、腐胺和尸胺是生物体内细胞重要的组成部分，在调节DNA、RNA和蛋白质合成及生物膜稳定性方面起着重要的作用，另外精胺对小肠也具有调节作用[11]；色胺能增加血压[12]；苯乙胺可以调节去甲肾上腺素水平，升高血压[13]；组胺能释放肾上腺素和去甲肾上腺素,刺激子宫、肠道和呼吸道的平滑肌,刺激感觉神经和运动神经,控制胃酸分泌[13]。但是生物胺的存在量具有一定的限制，过量就会对人体造成危害，其中以组胺为代表，会使人体出现头痛，消化障碍以及血压不稳，严重的会导致神经性中毒[14]；酪胺可使边缘血管收缩,心律加快,增强呼吸作用,同时还能增加血糖浓度,消除神经系统中的去甲肾上腺素,但过量会引起偏头痛[15]；尸胺和腐胺的毒性稍小，可引起低血压，破伤风，甚至四肢痉挛[12]。另外，腐胺、尸胺、亚精胺和精胺能够与亚硝酸盐反应产生致癌物质亚硝基胺[12]。

2 生物胺防控技术

目前世界上对金枪鱼的食用大多为生食，因此对金枪鱼的捕捞，保藏以及制作生鱼片的过程中的卫生安全控制得尤为重要。生物胺防控技术可以减少微生物的感染，降低生物胺的形成，是目前研究的一大热点。目前常见的生物胺防控技术可以分为三大类，分别为物理防控技术，化学防控技术以及生物防控技术。

2.1 物理防控技术

物理防控技术常见的有低温技术、气调技术[16]、辐照技术[17]，高压技术[18]以及臭氧技术[19]等。目前市场上应用最多的防控技术还是对金枪鱼进行低温处理。例如，李苗苗等[20]研究了4种保藏防控技术对金枪鱼片的贮藏影响，最后得出-1℃冰温贮藏能有效延长金枪鱼生鲜鱼片的货架期，且壳聚糖涂膜包装能够有效降低组胺的生成。雷志方等[21]也对不同温度下金枪鱼中生物胺含量进行了研究，最终发现低温能够明显抑制生物胺的出现。赵庆志等[22]对不同贮藏温度下鲐鱼的生物胺含量进行了研究，结果发现0℃条件下生物胺增长最为缓慢。

目前还有一些新型的抗菌包装技术应用到了一些新鲜食品领域，未来在鲜鱼包装方面有很大的发展潜力。在最有效的方法中，有机-无机包装，即聚合物包埋的金属纳米颗粒的组合被证明是非常有效的，特别是银纳米颗粒(AgNPs)具有抗微生物，抗真菌，抗酵母和抗病毒活性，并且可以与不可降解和可食用的聚合物组合用于活性食品包装，由于无法就其毒性做出结论性陈述，AgNPs在食品包装中的实际应用受到欧盟和美国食品安全当局的审慎监管，因此，它们的使用是根据Ag+迁移到包装食品中来评估的[23]。

2.2 化学防控技术

化学防控技术是指使用人工合成的化学物质来达到减少微生物污染的效果。例如闵娟等[24]研究了5%山梨酸钾在马鲛鱼储藏过程中能够有效抑制生物胺的生成。THIANSILAKUL等[25]将单宁和气调包装结合起来也对金枪鱼的生物胺防控起到了重要的作用。另外苯甲酸、丁基羟基茴香醚、硫酸钠等也能起到很好的生物胺防控作用[26]。但由于一些研究认为部分化学试剂使用后会有一定残留，因此化学防控技术在市场上的应用以及学术领域的研究在逐渐减少。

2.3 生物防控技术

生物防控技术是指使用从动植物、微生物中提取的天然的或利用生物工程技术改造而获得的对人体安全的生物试剂从而抑制微生物的生长，达到防控的目的。例如WU等[27]制备并表征壳聚糖-乳链菌肽(CS-乳链菌肽)微胶囊，在小黄鱼的贮藏期间检查其保存特性，观察到CS-乳链菌肽微胶囊抑制了微生物生长，尤其是与生物胺生成相关的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，同时，CS-乳链菌肽微胶囊也能防止脂质氧化和蛋白质降解，与单独的CS-乳链菌肽处理相比，储存期间将小黄鱼的保质期延长6～9 d。细菌素是目前研究较为火热的一种物质，SCHELEGVEDA等[28]发现将细菌素壳聚糖和乳酸钠结合，能够有效防止有害细菌和病原微生物的生长，并且其研究还发现细菌素能够有效抑制革兰氏阳性和阴性细菌，特别是在pH 5.5时，它能够控制鱼类细菌菌群的生长。李双双[29]研究了Nisin，茶多酚，水溶性壳聚糖以及金针菇提取液对腐败微生物的抑制作用，最终发现效果良好，且最佳浓度为0.4、6、15 g/L。还有一些其他新型生物试剂也有良好的防控作用，例如ε-聚赖氨酸[30]，姜精油[21]，生物酶类保鲜剂Cold-active蛋白酶和溶菌酶[31-32]等。

3 生物胺检测技术

在研究如何防止生物胺生成的同时，对生物胺检测技术的研究也是必不可少的一部分。

3.1 高效液相色谱技术

高效液相色谱技术(high performance liquid chromatography，HPLC)是目前最为常见的一种检测生物胺的技术。它的原理是样品溶液中的各组分在两相中有着不同的分配系数，在做相对运动时，经过反复多次的吸附解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，从而实现对不同组分的分离。由于生物胺分子本身既没有紫外可见光吸收，也没有荧光效应，因此在检测前，一般先要对生物胺进行衍生化处理。丹磺酰氯衍生剂价格低廉，反应生成的衍生物稳定性好，保存时间较长，所以是目前使用最多的衍生试剂。高效液相色谱技术已经相当成熟稳定，在一些水产品[33-35]，发酵肉制品[36]以及酒类等[37]生物胺的测定中都有了比较深入的研究。对于金枪鱼生物胺检测，目前国内也大都采用高效液相色谱技术，但该技术的研究近些年来已经遇到瓶颈，没有较大的突破，因此研究逐渐减少。最近的研究仅赵庆志等[22]对高效液相色谱技术进行了条件优化，采用丹磺酰氯衍生，最终可以在40 min内分离8种生物胺，且回收率高，线性关系良好。高效液相色谱技术灵敏度较高，能够实现大批量样品多种生物胺的同时检测，而且仪器使用普遍，因此现在是应用最广泛的生物胺测定技术。但使用高效液相色谱检测依然存在一些问题，比如前处理麻烦、检测分析时间长，有时重现性较差等。

3.2 液相色谱串联质谱技术

液相色谱串联质谱技术(high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry)是以液相色谱为分析系统，串联质谱为检测系统，样品在液相色谱部分与流动相分离，被离子化后经质谱的质量分析器将离子碎片按质量数分开，再经检测器得到质谱图。目前该方法研究生物胺所涉及的样品种类较多，例如南美白对虾、梭子蟹、鱼类等水产品[38-40]，对蜂蜜[41]，食醋[42]以及酒类等[43]产品中的生物胺都有所研究。其中，蒋林蓉等[44]采用改进的分散固相萃取法(quick easy cheap effective rugged and safe，QuEChERS)方法,利用液相色谱-串联质谱(RPLC-TMS),建立了几种水产品中生物胺的检测方法，结果显示，6种生物胺在10～200 ng/mL线性关系良好，方法的定量限(limit of quantity(LOQ),信噪比为10)为0.10 mg/kg，适用于水产品中生物胺含量的定性和定量检测。液质联用技术取代了许多耗时的分析程序，样品无需衍生，前处理简单，具有高效率、高可靠性及高灵敏度的优点。随着科技发展的逐渐成熟，液相色谱串联质谱技术会在更多的领域得到应用，在金枪鱼生物胺检测方面也会得到深入以及成熟的研究。

3.3 离子色谱技术

离子色谱技术(ion chromatography，IC)是高效液相色谱的一种，样品前处理无需衍生，主要利用被测物质的离子性进行分离和检测，目前较为成熟的应用就包括生物胺的检测。用Metrosep Cl分离柱，2.5 mmol/L硝酸/10%丙酮淋洗液进行淋洗，3 μL进样，可有效分析腐胺，组胺和尸胺等成分。目前离子色谱技术在许多水产品中有所应用，例如JASTRZBSKA等[45]建立了一种测定鱼类等食品中组胺、酪胺、苯乙胺、尸胺、腐胺5种生物胺的离子色谱-电导检测器方法，分离效果良好；孙永等[46]为了能够快速测定水产品中几种常见的生物胺，建立了抑制性电导检测-离子色谱法，该方法测定的线性范围为 0.02～10.0 mg，检出限在 0.5 mg/kg以下，加标回收率分别为 85.2%～106.9%，结果良好；周勇等[47]建立了离子交换色谱-柱后加碱脉冲积分安培检测法测定了冷冻黄鱼、冷冻鱿鱼和虾仁中10种生物胺，结果稳定,在线性范围内相关性也满足要求。离子色谱技术的前处理简单迅速,无需衍生，具有较好的重现性，分析时间较短，结果比较灵敏准确，适用于水产品中主要生物胺的快速检测，虽然样品中的阳离子会产生一定干扰，但在金枪鱼生物胺研究方面仍有很大的参考价值和开发前景。

3.4 毛细管电泳技术

毛细管电泳技术(capillary electrophoresis, CE)是利用高压直流电场在弹性石英毛细管通道中进行样品中各组分的驱动，然后依据各组分之间分配比不同而实现分离的电泳分离分析技术，它又分为许多分离模式，主要是利用毛细管区带电泳法和胶束电动力学毛细管电泳法进行生物胺检测。目前对于毛细管电泳技术检测生物胺更倾向于对技术本身的研究，例如开发一种快速、简单和灵敏的毛细管电泳技术,能同时检测3类无衍生化的生物胺[48]，或实现该技术在线富集与检测生物胺[49]，再应用到实际样品的分析检测中。当然，在实际应用方面，毛细管电泳技术也在水产品中的生物胺检测方面有所研究，像青蛾、花蛤和海瓜子等海产品[50]。目前该方法对金枪鱼生物胺的检测研究较少，相关研究有VITALI等[51]采用毛细管区带电泳快速选择性分离法测定金枪鱼鱼样品中组胺，最后检出限为0.14 mg/L，且线性关系良好。毛细管电泳技术具有灵敏度高,精密度高,成本低,分离检测快速(一般少于10 min) 等优点，期待在金枪鱼生物胺检测方面有更多以及更加成熟的相关研究。

3.5 电化学生物传感器技术

电化学生物传感器(electrochemical biosensor)就是将生物敏感分子固定在基础电极表面，然后通过生物分子间的特异性识别功能，选择性地识别目标分子并将其捕获到基础电极表面，电极作为信号传导器将电极表面发生的识别反应信号导出，变成可以测量的电信号，从而实现对分析目标物进行定量或定性分析的目的[52]。生物胺的测定是就是将生物胺通过一定的催化反应生成H2O2，再通过H2O2的含量去计算生物胺的含量。目前其方法侧重于对技术本身的研究，几乎没有涉及样品检测领域。例如POLONCA等[53]提出了一种基于SiO2传感器层的光学化学传感系统，用于在碱性条件下连续测定生物胺，如异戊胺、丙胺和腐胺等，该传感系统根据频谱特性、动态范围、灵敏度、响应和更新时间和传感器层老化时间进行了优化，并得到了不错的效果；屠青霞等[54]将三联吡啶钌的氨基衍生物与三异氰丙基三乙氧基硅烷进行化学键合生成衍生物,再应用溶胶-凝胶法(sol-gel)技术将Ru′-M-Si′修饰到氧化铟锡电极的表面,最终构成了固相电化学发光传感器，将制备的固相电化学发光传感器用于生物胺的定量检测，检出限在0.047～0.064 μmol/L，回收率在91.1%～104.3%，结果良好；HENAO等[55]建立了组胺脱氢酶与腐胺氧化酶双酶生物传感器对组胺与腐胺进行分析，组胺的检出限可达(8.1±0.7)μmol/L，腐胺可达(10±0.6)μmol/L。该技术优缺点都很明显，优点是快速、方便、可在线检测，缺点是酶电极的稳定性差，技术不完善，所需酶现在还无法合成，只能筛选，重现性较差，保存成本高。电化学生物传感器有着很广阔的发展前景，它所拥有的优势值得对该技术继续深入研究下去，使得这种技术更加成熟完善，今后可以应用到金枪鱼生物胺检测当中。

3.6 其他检测技术

除了以上几种目前应用较为广泛的技术之外，还有几种生物胺检测技术也有所研究。薄层色谱技术的原理是利用混合物中各组分在某一物质中的吸附或溶解性能的不同，使混合物的溶液流经该种物质，进行反复的吸附或分配等作用，从而将各组分开，虽然能实现快检，但准确度不高、重复性较差、操作麻烦，目前几乎在这个技术上不再进行大量研究，最近的研究仅为TAO等[56]建立了一种简单快速的薄层色谱-浓度测定技术，用于鱼和相关海产品中的组胺分析，组胺的检出限为20 mg/kg，效果良好；气相色谱技术是利用混合物中各组分在两相间的分配系数不同的原理，不同组分在固定相中滞留的时间不同，依次从固定相中流出分离，然后进入检测器进行检测，该技术一般用于分析挥发性胺，不易挥发性胺还需衍生，因此在水产品中生物胺的检测应用较少，LI等[57]建立一种气相色谱串联介质阻挡放电分子发射光谱仪分析测定了鲤鱼制品中二甲胺、三甲胺等挥发性胺；比色技术是通过比较或测量有色物质溶液颜色深度来确定待测组分含量的方法，LENG等[58]就建立了基于N-乙酰基转移酶(aaNAT)使生物胺乙酰化的快速检测生物胺的新型比色技术，灵敏性和选择性好，快速简便，成本低，但检测的生物胺种类少，易受其他物质的干扰，检测限较高，精确度低；核磁共振技术是研究处于强磁场中的原子核对射频辐射的吸收，从而获得有关化合物分子结构信息的分析技术，SHUNILINA等[59]为了评价在0℃和4℃条件下贮藏时大西洋鲑鱼片的品质而采用核磁共振技术测定了腐胺、酪胺、尸胺、三甲胺等指标的变化，方法简便、样品消耗少、灵敏度高、准确度高、分析速度快,可将定性鉴别和定量分析同步完成，但所需仪器设备昂贵,实用性极为有限；酶联免疫技术就是让抗体与酶复合物结合，然后通过显色来检测，可根据颜色反应的深浅来进行定性或定量分析，MUSCARELLA等[60]同时用ELISA与HPLC测定311份鲜鱼与鱼制品中的组胺含量，发现2种方法测出的数据基本一致，且样品前处理快速，操作简单，特异性强，灵敏度高，检测限低并且成本较低，但较难进行不同种生物胺含量的测定，并且抗体制作困难，容易出现交叉反应以及假阳性等现象，因此一般用于低含量的测定，目前只在组胺的测定上有一些应用。

这些技术在水产品的生物胺检测方面都有了比较好的成果，对今后金枪鱼生物胺的检测和研究起到了很好的借鉴作用。

4 结论与展望

近些年来，金枪鱼越来越受到各国消费者的青睐，生食金枪鱼片已经渐渐成为一种饮食流行趋势，所以其肉质的品质和安全问题就会成为消费者最关注的方面。由于金枪鱼肉质的特殊性，保藏不当的情况下容易产生大量生物胺，不仅影响鱼肉的品质，而且危害消费者的身体健康。

对金枪鱼中生物胺的防控技术以及检测技术，目前都有了比较成熟的研究成果。采用更加合理有效并且成本较低的生物胺防控技术来延长其货架期，保证其肉质鲜美，是我们需要进一步研究的方向。目前市场最普遍的是使用低温防控技术，虽有效，但会在一定程度上影响鱼肉的口感，因此就有了其他防控技术的研究。经过许多研究表明，在适当低温的情况下，结合一些其他防控技术不仅能得到更好的防控效果，并且能使肉质保持鲜美，复合防控技术有着广阔的研究前景。

其次在金枪鱼生物胺的检测技术方面，我国目前基本上是以HPLC的方法来进行检测，但是这种方法前处理较为复杂，检测时间也较长，并不十分适合进行大批量的样品检测。本文中介绍到的其他技术，有的虽然简单，耗时少，但研究还不够成熟，方法不够稳定，因此不能够得到广泛应用。目前，关于金枪鱼生物胺检测技术的研究发展，倾向于建立一种更加快速、高效、稳定、成本低、可以同时检测多种主要生物胺的技术。现阶段，关于这种理想中的检测技术，只有组胺的快速检测试剂盒有所突破，但还需要降低试剂盒的成本。其他生物胺或者多种生物胺的快检还没有突破。

无论是生物胺的防控技术还是检测技术，今后的研究发展方向是在降低成本的同时能够更加快速有效地达到理想的目的，保障水产品的安全。