天然多糖的硫酸化修饰对其生物活性影响研究进展

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(1.桂林旅游学院,酒店管理学院,广西桂林 541006;2.合肥工业大学,食品科学与工程学院,安徽合肥 230009)

多糖是一类在动植物和微生物体内广泛存在且种类繁多的生物大分子,具有抗氧化、抗肿瘤、抗凝血、抗病毒等生物活性[1-2]。由于其具有独特的药理活性且毒性低,引起了食品和生物医学领域研究人员的极大关注[3]。纵观近几十年的研究发现,多糖在生命体的生长和发育过程中起着重要作用[4]。但通常情况下,天然多糖的生物活性较弱,因此常采用一些方法改善其生物活性,而硫酸化修饰是天然多糖结构修饰的常用方法之一。迄今为止,天然多糖常用的硫酸化修饰方法主要包括浓硫酸法、氯磺酸-吡啶法、三氧化硫-吡啶法等。应用硫酸化修饰方法,对天然多糖的化学结构进行改造,可改善多糖的生物活性,如抗病毒类硫酸化多糖,增强了其抗病毒活性,该硫酸化多糖衍生物己进入临床研究阶段。

多糖硫酸化修饰,是指利用硫酸化修饰方法,使得多糖分子中的羟基被硫酸基取代形成多糖硫酸化衍生物的过程。很多学者研究发现,多糖的生物活性与其结构有关,通过硫酸化修饰,可以改善多糖原有的生物活性或产生新的功能活性[5-6]。本文阐述了天然多糖的硫酸化修饰方法及其对生物活性的影响研究,以期为今后开展硫酸化多糖的深入研究及开发应用提供参考。

1 天然多糖主要的硫酸化修饰方法

1.1 浓硫酸法

浓硫酸法,是用浓硫酸作为多糖硫酸化基团的来源,其反应原理是在酯化反应过程中,硫酸作为一种酯化试剂,在吡啶的催化下,实现对天然多糖的结构修饰。反应结束后,调节混合溶液的pH至中性,然后进一步浓缩和冷冻干燥,得到硫酸化多糖[7]。浓硫酸法的优点是反应条件稳定、试剂毒性相对较低。然而,缺点是反应过程中伴随有硫酸多糖的碳化和降解。Jiang等[8]采用浓硫酸法制备了硫酸化龙眼多糖,傅里叶变换红外光谱分析结果表明,其结构中存在S=O和C-O-S键,显示其发生了硫化反应。Sun等[9]利用浓硫酸法制备了一系列具有不同硫酸根取代度和分子量的多糖硫酸衍生物,并以三氧嘧啶-吡啶络合物为试剂进一步合成出了硫酸化的(1-3)-β-D-葡聚糖。Zhu等[10]采用浓硫酸法制备了硫酸化虫草多糖,并通过对硫酸化多糖进一步磺化处理,提高了天然多糖的抗肿瘤活性。

1.2 氯磺酸-吡啶法

采用氯磺酸-吡啶法对天然多糖进行硫酸化修饰,其原理是多糖溶解于溶剂中与酯化试剂进行反应,致使多糖残基上的某些羟基被酯化试剂提供的硫酸基团取代,经透析和冻干后获得硫酸化多糖[11-12]。反应过程中所用的试剂比例、反应时间和反应温度是影响多糖硫酸取代度的三个主要因素。通常采用正交试验和响应面试验优化天然多糖硫酸化修饰的最佳反应条件[13-14]。氯磺酸吡啶法中所用的氯磺酸是一种强酸,在酸性条件下可促进多糖的降解,在硫酸化修饰过程中提供硫酸基团,进而改变多糖原有的分子结构。Wei等[15]将实验过程中的吡啶替换成4-二甲氨基吡啶(DMAP),可进一步优化硫酸化修饰效果。这种方法的优点是产率高、原料廉价易得、可以得到高取代度的产物,回收方便,而缺点是氯磺酸有剧毒,需要提前准备试剂,反应过程剧烈。

1.3 三氧化硫-吡啶法

三氧化硫吡啶法,也是天然多糖硫酸化修饰的常用方法。首先,将三氧化硫放入三颈烧瓶中,加入吡啶后连续搅拌。然后在适当温度下加入多糖粉末,反应结束后冷却至室温,氢氧化钠调节混合液的pH至中性。最后,经过乙醇沉淀、流水透析和冷冻干燥后,获得硫酸化多糖[16-17]。三氧化硫法的优点是操作简单方便,可以得到较高硫酸化基团取代度的多糖衍生物。其缺点是所用试剂昂贵,不适用于大批量制备硫酸化多糖。

2 硫酸化多糖的生物活性

2.1 抗氧化活性

天然多糖因其本身大量存在的羟基及其糖蛋白复合物而具有抗氧化活性[18]。通过使用多种化学修饰和结构改造方法,对多糖的分子结构进行衍生修饰,其生物活性也会发生一定程度的改善,而硫酸化修饰已被广泛应用于增强多糖的抗氧化活性。

申进文等[19]比较了硫酸化香菇多糖6种不同组份的抗氧化活性,结果显示,硫酸化香菇多糖具有抗氧化活性,并且存在不同程度的量效关系。多糖的分子量不同,硫酸化香菇多糖的抗氧化活性存在差异,烤烟多糖的硫酸化修饰和抗氧化活性的研究中也得到类似的结论[20]。刘玉凤等[21]研究了肠浒苔多糖硫酸化取代度与抗氧化活性的关系,结果表明,随着硫酸化多糖的硫酸根取代度的上升,其抗氧化性呈现先增大后减小的趋势。

多糖的硫酸根取代度差异对其生物活性也产生一定的影响。Wang等[22]通过对白沙蒿多糖(Artemisiasphaerocephalapolysaccharide,ASP)进行硫酸化修饰,制备了具有5种不同硫酸根取代度的硫酸化衍生物,通过体外评价硫酸化衍生物结构和抗氧化活性关系,结果发现,硫酸化白沙蒿多糖(SASP)显示出比天然的白沙蒿多糖更好的抗氧化活性,硫酸根基团取代度对抗氧化活性具有显著的影响。Xie等[23]利用吡啶-三氧化硫作为硫酸化修饰试剂,对青钱柳多糖(Cyclocaryapaliuruspolysaccharide)进行硫酸化衍生,制备了4种具有不同取代度(0.12～0.92)的硫酸化衍生物,结果证实青钱柳多糖经过硫酸化修饰后,其多糖分子中的糖醛酸含量、多糖分子量、单糖组成和多糖分子构象均发生了明显的变化。通过进一步的理化性质及生物活性分析实验,揭示了硫酸化衍生物的化学组成、分子量和一些必要的结构单元是决定其抗氧化活性的主要因素。Xu等[24]使用氯磺酸/吡啶(CSA/Pyr)的方法对迷果芹多糖(SGP)进行化学修饰,以获得其硫酸化衍生物(S-SGP),与SGP相比,S-SGP具有相对较低的分子量,单糖组成未发生变化,抗氧化活性测定实验结果显示,S-SGP拥有比SGP更好的抗氧化活性,表明S-SGP的抗氧化性可能与多糖分子量及硫酸基团取代度有关。

2.2 抗凝血活性

采用不同的硫酸化条件,以获得不同硫酸根取代度和分子量的多糖衍生物,和天然多糖相比,其抗凝血活性会得到进一步增强。Du等[25]从粒毛盘菌中分离得到胞外多糖(LEP-1),并对其进行硫酸化修饰得到硫酸多糖SLEP-1,取代度为1.97。体外抗凝血活性实验结果发现SLEP-1与LEP-1均可以有效延长正常小鼠血浆的凝血活酶时间(APTT)和凝血酶时间(TT),并呈剂量效应关系,SLEP-1比LEP拥有更好的抗凝血活性。Lu等[12]利用CSA-Pyr方法对柿子多糖进行硫酸化修饰制备硫酸化柿子多糖,通过凝血实验测定APTT研究其硫酸化多糖的抗凝血活性,结果表明,硫酸化柿多糖的抗凝活性不仅强烈依赖于硫酸根取代度和多糖分子量,而且还依赖于硫酸化条件。肝素是由两种以上多糖相互交织链接的硫酸化多糖聚合物,体内外实验及临床显示,其具有抗凝血活性。

少量研究表明,目前包括肝素在内的治疗凝血的药物往往会引起不正常的流血现象、血小板减少现象等副作用[26-27]。源自我国的传统中药红芪的红芪多糖硫酸酯,是一种天然的硫酸化多糖,特点是硫酸根取代度较低,而且本身没有抗凝血活性。郭龙等[28]制备出不同硫代度的硫酸化红芪多糖(SHG),体外实验结果表明,高硫酸根取代度的红芪多糖具有较好的抗凝血活性,并且随硫酸根取代度的不断增大,其抗凝血活性呈现出不同程度的改善。另外的一些研究表明,白树花多糖硫酸酯、玉米芯硫酸化多糖、黑灵芝葡聚糖高活性硫酸化多糖等都是一类高抗凝血活性的硫酸化多糖[29-31]。

2.3 抗肿瘤活性

肿瘤,一直是迫害人类健康的可怕疾病之一。许多研究证实,硫酸化多糖通过抑制肿瘤细胞的生长繁殖、致使肿瘤细胞死亡、使肿瘤细胞停滞在特定的细胞周期、干扰肿瘤细胞的转移等多种形式可以发挥抗肿瘤作用[32]。

王君敏等[33]利用氯磺酸-吡啶法对枸杞多糖进行硫酸化修饰,得到3种硫酸化枸杞多糖sLBPS30、sLB-PS70和sLBPS,检测了这三种多糖对小鼠脾淋巴细胞增殖和食管癌EC109细胞的影响,结果表明,经硫酸化修饰后的多糖能显著增强体外脾淋巴细胞增殖,同时促进淋巴细胞的四种细胞因子的分泌,并能抑制EC109细胞生长,降低EC109细胞迁移速率,且与硫酸基含量有一定的关系。从药用真菌茶藨子木层孔菌中分离得到葡聚糖茶藨子木层孔菌多糖(PRP),研究结果显示,PRP不能使得肿瘤细胞生长受到抑制。然而,通过进一步的硫酸化后,PRP对肿瘤细胞的生长表现出显著的抑制作用[34]。

目前的研究表明,岩藻多糖硫酸酯可以通过诱导HeLa细胞发生凋亡以及自噬性程序性细胞死亡,从而抑制癌细胞的生长[35]。Wei等[15]从红芪根茎中分离纯化获得红芪多糖(Radix hedysari polysaccharide,RHP),并利用氯磺酸法,用DMAP作为催化剂制备了红芪多糖的四种硫酸化衍生物RHPS。与RHP相比,所有RHPS对A549细胞和BGC-823细胞均表现出显著的抑制作用。流式细胞实验结果表明,RHPS可以使A549细胞和BGC-823细胞的生长阻滞在细胞周期的G1期,经硫酸化修饰后,其抗肿瘤活性得到了显著增强。Zhu等[10]通过对古尼虫草多糖(Cordyceps_gunnii mycelia polysaccharide)进行硫酸化修饰获得硫酸化多糖SPS50,细胞实验结果显示,SPS50对K562细胞的生长表现出明显的抑制作用,抑瘤率为69.92%,其抗肿瘤活性明显优于PS50。Jiang等[8]采用硫酸法对龙眼多糖(longan polysaccharide,LP)进行硫酸化修饰,得到一种硫酸化衍生物LP1-S。细胞实验结果表明,LP1和LP1-S可以刺激淋巴细胞和巨噬细胞的增殖,呈剂量依赖关系。LP1和LP1-S对HONE1肿瘤细胞的生长均表现出明显的抗肿瘤活性,且LP1-S的抗肿瘤活性比LP1更强。

通过特定的硫酸化修饰方法,改变其天然多糖原有的硫酸根取代度,可增强其抗肿瘤活性。Li等[36]从脱脂米糠中分离纯化获得米糠多糖(Rice bran polysaccharide,RBP),并采用氯磺酸-吡啶法(CSA-Pyr)制备了9种具有不同硫酸根取代度的硫酸脱脂米糠多糖(sRBPS),MTT法测定其抗肿瘤活性实验结果表明,当硫酸根取代度在0.81～1.29范围内时,碳水化合物含量在41.41%～78.56%范围内,硫酸化衍生物在体外表现出相对强的抗肿瘤活性,其中具有最高硫酸根取代度(1.29)和碳水化合物含量(78.56%)的sRBPS2对B16和HePG2细胞表现出更加明显的生长抑制。

2.4 抗病毒活性

研究表明,经过硫酸酯化后硫酸酯化多糖具有更加显著的抑制HIV活性[37-38]。王欢等[39]用氨基磺酸法对党参多糖(Codonopsispilosulapolysaccharides-1,CPPS-1)进行硫酸化修饰,检测修饰前后CPPS-1对体外抗Ⅰ型单纯疱疹病毒(Herpessimplexvirus type I,HSV-I)的作用,发现CPPS-1对HSV-I有一定的预防效果,但无治疗效果,而经过硫酸化修饰后的CPPS-1对HSV-I具有较好的预防及治疗效果。Zhao等[40]对银耳多糖(Tremellapolysaccharide,TPS)进行硫酸化修饰得到两种硫酸化衍生物sTPStp和sTPS70c,用未硫酸化的三种多糖TPStp,TPStc和TPS70c作为对照,进行新城新城疫病毒(NDV)感染细胞实验,结果表明,5种多糖均可以显著抑制NDV对鸡胚成纤维细胞的感染能力,且硫酸化衍生物sTPStp对NDV病毒的抑制率最高。Lu等[13]通过氯磺酸-吡啶法对淫羊藿多糖(Epimediumpolysaccharide,EPS)进行硫酸化修饰,获得9种硫酸化多糖EPS(sEPS),包括sEPS1,sEPS2,sEPS3,sEPS4,sEPS5,sEPS6,sEPS7,sEPS8和sEPS9,利用MTT实验分析它们对IBDV感染CEF细胞的影响,结果表明,修饰的sEPS具有比原糖EPS有更加显著增强的CEF抵抗IBDV感染,特别是sEPS2和sEPS5，具有更好的抵抗IBDV感染CEF细胞的能力。总的来说,硫酸化修饰改变了天然多糖原有的化学结构,使其特定的生物活性得到进一步活化。

3 展望

硫酸化多糖作为经硫酸化修饰而生的产物,具有广泛的抗氧化、抗凝血、抗肿瘤、抗病毒等多种生物活性和药理作用。纵观现有资料,很多学者在活性成分提取、分离纯化、结构鉴定、功能活性及作用机理等方面做了大量的研究工作,但硫酸化多糖作为一种衍生物,其特定结构与活性的内在联系尚不清楚,仍需要进一步研究其结构与生物活性的作用机制,揭示出生物活性多糖的结构基础。随着人们对硫酸化多糖研究的逐步深入,必将使得硫酸化多糖的应用领域得到进一步拓宽。