乳酸乳球菌噬菌体与宿主相互作用研究进展

赵慧莹,李言郡,陈 苏,欧 凯,王 健,何国庆,*

(1.浙江大学生物系统工程与食品科学学院,浙江杭州 310058; 2.杭州娃哈哈科技有限公司,浙江杭州 310009)

近年来,我国发酵乳制品市场快速发展,市场需求增大促使发酵乳制品产量大幅提升。发酵剂易受噬菌体感染,从而影响乳品酸化率及其风味,甚至导致发酵失败,因此噬菌体被认为是乳品生产加工环境的主要威胁因子[1]。许多乳品发酵工厂采取菌种轮换、净化生产环境、使用噬菌体抑制剂、高温处理等措施[2]来控制噬菌体污染,但由于乳品发酵工厂并非无菌环境,而且有时杀菌的条件不足以使一些耐热噬菌体完全失活[3],这个问题难以得到彻底解决。

乳酸乳球菌和嗜热链球菌被广泛应用于发酵乳制品中,因此国内外研究大多集中在探索乳酸乳球菌、嗜热链球菌等模型噬菌体与对应乳酸菌宿主间的相互作用关系上[4-7],尤其是在乳酸乳球菌噬菌体的研究中,发现噬菌体吸附感染宿主的相关机制,为研究新的乳酸菌噬菌体及其宿主的相互作用奠定了基础。噬菌体感染乳酸乳球菌的第一步就是受体结合蛋白(Receptor Binding Protein,RBP)与受体相互作用,本文从乳酸乳球菌噬菌体吸附受体和受体结合蛋白两方面对乳酸乳球菌噬菌体-宿主相互作用进行综述,以期为研究其他乳酸菌噬菌体种群及防治措施提供一定的理论基础。

1 乳酸乳球菌噬菌体的分类

噬菌体是感染细菌、真菌等微生物的病毒总称,部分能引起宿主菌的裂解。根据噬菌体对宿主细胞的影响可将噬菌体分为烈性噬菌体和温和噬菌体[8],根据被侵染乳酸菌菌株的不同将乳酸菌噬菌体分为乳酸乳球菌噬菌体、嗜热链球菌噬菌体、植物乳杆菌噬菌体等。此外,也可根据形态特征进行分类,乳酸菌噬菌体几乎都归属于尾病毒目,分成肌尾病毒科、长尾病毒科以及短尾病毒科[9]。

乳制品发酵常用的乳酸菌有乳球菌、乳杆菌、链球菌和明串珠菌等[10],乳酸乳球菌是乳品发酵领域中使用最广的发酵剂,其噬菌体的结构、基因组多样性和噬菌体-宿主相互作用的研究也最为深入[11]。根据遗传和形态特征将乳酸乳球菌噬菌体分为十个不同的群体,在乳制品生产中最常见的有三类,即烈性的936型、c2型噬菌体、含有烈性和温和噬菌体的P335型噬菌体[12]。烈性噬菌体侵染宿主细胞后能引起宿主细胞裂解,在短时间内就可完成吸附、侵入、增殖、装配、裂解这五个过程;P335型噬菌体中温和噬菌体吸附侵染宿主细胞后会将其核酸整合到宿主菌的染色体上,与其一同复制,并不进行增殖,也不会引起宿主细菌裂解,使宿主以溶源性细菌的形式存活,但在温度、丝裂霉素、紫外线等诱导下可转变成烈性噬菌体并释放噬菌体颗粒[13]。

2 乳酸乳球菌噬菌体-宿主相互作用

2.1 乳酸乳球菌噬菌体侵染过程

在噬菌体侵染乳酸乳球菌宿主的过程中,噬菌体首先接触并吸附在细菌的细胞壁上。乳酸乳球菌噬菌体对宿主的识别取决于噬菌体表面的特异性受体结合蛋白,其可以识别在宿主菌细胞表面的蛋白质或碳水化合物受体并与之结合[14]。在侵染的第一步,RBP识别受体结合部位是可逆的,因此无法确保噬菌体可以成功侵染宿主菌。在第二个阶段,噬菌体在位于细菌细胞表面的蛋白质之间与细胞发生不可逆的结合[15]。该特定结合位点主要是位于细胞壁上的糖类,常见的有半乳糖、葡萄糖、鼠李糖、半乳糖胺化合物等[16]。随后,噬菌体将头部的遗传物质注入到宿主细胞质中,其蛋白质外壳留在外面。进入裂解模式的噬菌体立即开始利用宿主细胞内的物质复制遗传物质、合成噬菌体编码蛋白,最后产生释放大量的噬菌体后代粒子;而溶源性噬菌体则进入其溶源性周期[13]。

2.2 乳酸乳球菌噬菌体受体结合蛋白

1993年,c2噬菌体RBP被首次鉴定[17],在九十年代末和二十一世纪初期,人们获得了第一批有代表性的936型和P335型噬菌体的基因组序列,其中最重要的是936型噬菌体sk1和bIL170和P335型噬菌体TP901-1和Tuc2009的基因组序列的发现,使得基于基因组学来研究这些噬菌体群体的噬菌体-宿主相互作用成为可能。2004年,936型噬菌体sk1和bIL170的RBP被确定,通过假想噬菌体的构建确定了编码宿主细胞表面假定糖受体的遗传元件,成为相互作用研究中最重要的转折点之一[12,18]。随后P335型噬菌体TP901-1和Tuc2009的RBP也很快被确定,且这些噬菌体也能识别细胞表面的碳水化合物[19],该类噬菌体RBP的氨基末端是保守的,而羧基末端存在差异,表明后者与噬菌体和宿主受体之间相互作用的特异性有关[20]。

尽管乳酸乳球菌噬菌体群内的基因序列不相似,甚至不在同一个属,但它们的基因结构模块都是保守的[21]。因此在已经过深入研究的噬菌体如TP901-1,Tuc2009和p2的基础上,可以推测许多基因产物的功能。噬菌体p2和TP901-1具有各自独特的RBP基因,然而它们的RBP结构中都具有相似的结构排列。乳酸乳球菌噬菌体的RBP包含三个功能区域,即与宿主受体相互作用的头部区域、与基板激活器相连的肩膀区域以及作为头部和肩膀区域之间桥梁的颈部区域[22-26]。虽然RBP的模块性质是保守的,但也存在细微的差异,这很好地解释了噬菌体与其宿主相互作用的特异性。乳酸乳球菌噬菌体之间RBP的肩部区域非常相似,这是因为它们与噬菌体元件相互作用,而与宿主细胞表面的特定受体相互作用的头部区域是不同的[24]。

2.3 乳酸乳球菌噬菌体吸附受体

1994年,Schouler等[27]获得了第一个乳球菌噬菌体的完整基因组序列,该c2型噬菌体可识别乳酸乳球菌细胞壁上的一种保守蛋白,被命名为噬菌体感染蛋白(Phage Infection Protein,PIP)。随后研究人员筛选到抗c2型噬菌体菌株,该菌株编码PIP的基因自发缺失,此后人们分离到c2型噬菌体的频率逐渐降低。然而PIP的编码基因有所缺失的抗c2型噬菌体菌株再次自发突变,c2型噬菌体在乳品发酵设备中再次被分离得到[28-29],该发现表明菌株自发突变产生的噬菌体抗性不稳定,容易再次突变失去抗性,往后的研究或可通过基因工程的手段除去c2噬菌体敏感菌株中的PIP编码基因,从而获得对c2型噬菌体拥有稳定抗性的乳酸乳球菌菌株。

在噬菌体基因组序列未知的情况下,噬菌体的尾尖形态可提供关于受体的信息。TP901-1和Tuc2009噬菌体的宽基板结构,或是936型噬菌体离散的基板结构,均可识别细胞表面的糖受体——细胞壁多糖(cell wall polysaccharides,CWPSs)。CWPSs是按特定格式排列的杂多糖,噬菌体与宿主结合需要蛋白质-蛋白质和蛋白质-碳水化合物的相互作用同时进行,以确保噬菌体和宿主之间的成功吸附,这就需要尾尖提供多个RBP,如TP901-1/Tuc2009和p2的基板中分别含有54和18个受体结合单元[23,25-26];而末端或尾部纤维粗短的噬菌体,如乳酸乳球菌c2型噬菌体和德氏乳杆菌噬菌体LL-H,可识别细胞表面的蛋白质或脂磷壁酸(lipoteichoic acid,LTA)受体[30]。在噬菌体识别蛋白质的情况下,因为蛋白质之间的相互作用比蛋白质碳水化合物的相互作用强,小尾巴或尾纤维足以进行蛋白质-蛋白质相互作用。同样,由于LTA主要由核糖醇或磷酸甘油重复单位组成,结构保守而缺乏多样性,噬菌体识别LTA不要求基板有特定的空间排列[31],粗短的尾部足以识别并结合受体。

Vinogradov等[32]将P335型和936型噬菌体的受体明确地定义为由高度可变的CWPSs组成的特定多糖,迄今发现的乳酸乳球菌的CWPSs均包含一种富含鼠李糖的多糖,Mahony等[20]利用多重PCR技术根据基因型将乳酸乳球菌的CWPSs分为A、B和C三个类型。三种类型的CWPSs都含有带负电荷的寡糖/多糖,其在A型和B型菌株中以共价键与鼠李糖相连,而C型菌株的多糖和鼠李糖之间的确切联系有待确定[33]。Ainsworth等[34]对C型CWPSs操纵子进行了深入的分析,根据主要编码糖基转移酶操纵子内的可变区发现该组中至少有五个亚组。

目前已知三种乳酸乳球菌C型CWPSs的生化结构,第一个具有代表性的是乳酸乳球菌菌株MG1363的CWPSs,MG1363是936型噬菌体p2的宿主[35];第二个是P335型噬菌体TP901-1的宿主3107的CWPSs[34];第三个是近年来新发现的乳酸乳球菌1358型噬菌体的宿主L.lactisSMQ-388的CWPSs[36]。Mccabe等[37]通过比较这些菌株CWPSs生化结构,发现在重复多糖单元的还原末端有一个半保守三糖;由于1358型噬菌体不能感染MG1363,却能够感染L.lactisSMQ-388和3107,因此推测这两种菌的核心三糖(这两种菌的三糖相同,与MG1363稍有不同)是该类噬菌体可识别的一种特异性三糖;为证实该推论,研究人员合成该半保守三糖并利用X射线晶体学研究评估其与受体结合位点结合的能力,发现该三糖占据了1358型噬菌体RBP头部区域内的缝隙,从而起到受体结合和宿主识别作用。基于此,可推测噬菌体TP901-1和p2也可识别这种三糖,且相互作用的特异性是由该多糖的还原末端的组成和性质造成的。此外,另两类乳酸乳球菌949型和P087型噬菌体已被证明能够识别各自宿主细胞表面的CWPSs,通过对其宿主菌株的CWPSs进一步的生物化学分析,未来的研究可能会揭示这些噬菌体可识别的特定碳水化合物的结构[38]。

目前在已知的十类乳酸乳球菌噬菌体中只发现一类识别蛋白质受体(c2),以及五类可识别乳球菌细胞壁上的CWPSs(P335、936、1358、949和P087),而其余乳酸乳球菌噬菌体的宿主范围狭窄,因此,研究人员推测这些噬菌体极有可能也识别细胞表面上的CWPSs,这个推论与Oliveira等[39]的发现相符。虽然Legrand等[40]已经对P335型噬菌体吸附受体及其RBP结构进行了详细研究,但碳水化合物受体的确切性质和组成仍然未知;936型噬菌体的RBP序列和CWPSs基因型间存在相关性,可在后续研究中用来预测乳酸乳球菌菌株对936型噬菌体的敏感性。阐明乳酸乳球菌菌株的CWPSs结构是认识噬菌体识别过程的关键,目前已知的三种C型菌株的CWPSs对分析A型和B型CWPSs的生化组成和结构、加深对受体多样性和乳酸乳球菌噬菌体与宿主间相互作用的理解起着至关重要的作用。

3 展望

近年来,随着对乳酸菌噬菌体及其宿主的基因组、生化结构的深入研究,研究者对它们之间相互作用的理解也不断加强。乳酸乳球菌噬菌体作为研究乳酸菌和革兰氏阳性菌噬菌体的良好模型,最常见的三类乳酸乳球菌936型、c2型、p335型噬菌体的受体结合蛋白已被确定,细胞表面多糖成分是主要的受体物质,且这些糖的组成和排列决定了噬菌体-宿主相互作用的特异性。乳酸菌如嗜热链球菌、乳酸杆菌及明串珠菌的受体结合蛋白编码基因和受体也相继被揭晓。新型乳酸菌噬菌体基因组的释放意味着还有很多相互作用有待探索,了解这些相互作用对乳品工业解决无处不在的噬菌体问题至关重要。

从最近乳酸菌噬菌体的研究中可以看出,为了完全理解噬菌体-宿主相互作用,需要对噬菌体和宿主展开遗传学和生物学研究,才能确定噬菌体感染以及噬菌体和宿主共同进化的机制,从而制定相应的防治措施。可以利用转录组学揭示噬菌体感染对宿主细胞基因表达模式的影响。随着这项技术的发展和此类研究的出现,噬菌体-宿主相互作用的模式和噬菌体感染的机制也会被逐渐揭晓,未来可能会采取更多样的措施来控制噬菌体污染。此外,通过对噬菌体和宿主菌组合的基因组进行测序分析,更加深入的了解噬菌体与宿主之间的关系,确定噬菌体识别宿主所需的蛋白质和碳水化合物受体的主次性,从而制定遗传标记以筛选出对噬菌体不敏感的工业菌株。未来的乳酸菌噬菌体生物学研究主要依靠组学和结构分析技术来阐明噬菌体-宿主相互作用,开发出新的噬菌体控制措施与宿主编码的噬菌体抗性系统共同作用,从而降低噬菌体污染的可能性。