FTIR 显微红外光谱结合化学计量学在烧死鉴定中的研究

张 忠，薄彦乐，罗仪文，林汉成，王 磊，黄 平，李周儒，陈丽琴

（1.内蒙古医科大学 法医学教研室，内蒙古 呼和浩特 010030；2.司法鉴定科学研究院 上海市法医学重点实验室上海市司法鉴定专业技术服务平台，上海 200063；3.宝鸡市扶风县公安局 刑事科学技术室，陕西 宝鸡 722200；4.徐州医科大学 法医学教研室，江苏 徐州 221004）

在法医学实践中，面对火场中发现的尸体，快速准确的判断烧死还是死后焚尸，可为明确死因，判断火场性质提供重要信息[1]。 通常，法医根据尸表特征检验、呼吸道和消化道有无炭末沉积以及心血中碳氧血红蛋白含量检测等方法鉴别烧死和死后焚尸[2-3]。 然而，这些方法或依靠主观经验或受限于火场情况，很难客观准确地鉴别烧死和死后焚尸[4]。近来，有学者利用尸体征象和免疫组织化学等方法探究烧死尸体的特征变化，包括分析舌尖与牙齿的位置关系，皮肤水通道蛋白3 等表达[5-6]。但据报道，舌尖位置与烧死的关系还需要进一步的研究证实[7]。 而免疫组织化学方法需要昂贵的实验试剂和复杂的实验流程，限制了其在法医学实践中的应用。 因此，烧死的法医学鉴定和研究仍需一种更加简便、可靠的实验手段。

构成机体组织和细胞的基本物质是蛋白质、糖、脂肪和核酸等。 外界环境作用于机体主要引起相应生物分子含量、结构以及化学基团的变化。 烧死通常会使受害者吸入火场中燃烧所产生的高温烟雾，对肺支气管上皮组织和细胞产生直接或间接的影响[8]。 傅里叶变换红外（fourier transform infrared reflection，FTIR）光谱技术是研究生物组织和细胞分子结构和化学基团的有效手段，具有灵敏度高、分析速度快、无损检测等优点[9]，被广泛地应用于生物医学、食品工业、药品检测等多个领域[10-12]。 化学计量学方法是基于统计学、计算机科学等学科的方法和原理，挖掘与处理数据信息，获取复杂分析体系中的有用信息[13]。 红外光谱结合化学计量学方法能最大限度地提取光谱信息，具有分析效率高，分析结果的重复性和再现性优于常规分析方法等特点。目前，该方法已成功地应用于法医学领域，如血痕形成时间推断、血痕种属鉴别、复杂性死因鉴定以及皮肤电损伤鉴定等[14-18]。 因此，本研究运用FTIR技术结合化学计量学原理算法对烧死和非烧死肺组织支气管上皮进行分析，旨在为烧死法医学鉴定和研究提供新的辅助性手段。

1 材料与方法

1.1 样本收集和准备

收集10 例烧死尸体肺组织，其中男性7 例，女性3 例，平均年龄39.5 岁；20 例非烧死案例肺组织，其中男性11 例，女性9 例，平均年龄41.8 岁，死因包括心血管疾病、颅脑损伤、失血性休克。 以上案例来源于司法鉴定科学研究院及内蒙古医科大学法医学教研室。 每例肺组织在左右肺上下叶至少取材4 块，大小为10 mm×10 mm×3 mm。 经4%甲醛固定后常规制作蜡块。 对于肺组织样本，行连续切片，一张厚度4 μm，铺于普通玻璃载玻片上，另一张厚10 μm，铺于氟化钡载玻片上。 所有切片常规方法脱蜡。 将普通玻璃载玻片上的组织行常规HE 染色。 氟化钡载玻片上的组织无需染色，直接进行光谱扫描。

1.2 光谱的采集和预处理

应用傅里叶变换红外光谱仪（Nicolet6700，Thermo Fisher Scientific，美国）、红外显微镜（Niclot continuum microscope, Thermo Fisher Scientific，美国）及其配备工作站OMNIC 8.0 采集肺组织支气管上皮细胞区域的红外光谱。 扫描条件：透射模式，经液氮冷却，室温，扫描范围为4 000～900 cm-1，光栅直径50×50 μm2，扫描次数为32 次，分辨率为8 cm-1。 每个样本检测前在氟化钡载玻片的空白区域进行背景扫描。 烧死组，先在肺组织HE 染色切片上确定肺支气管上皮区域，然后于氟化钡载玻片组织对应区域采集外光谱；对照组，直接收集肺支气管上皮红外光谱。 应用Matlab R2016a（MathWork，美国）软件进行数据预处理。 光谱使用9 点SG 平滑转化为二阶导数变换，然后进行多元散射校正消除因组织厚度不均导致光谱差异的影响，增强与成分含量相关的光谱信息。 在本研究中，选取1 800～1000cm-1的生物指纹区光谱。包括酰胺Ⅰ带（1600～1690cm-1），酰胺Ⅱ和Ⅲ带蛋白质（1480～1575cm-1,1229～1 301 cm-1）[19]。

1.3 数据分析

数据采用PLS Toolbox8.5.2 的Matlab R2016a软件进行主成分分析（principal component analysis,PCA）和偏最小二乘判别分析（partial least squares for discriminant analysis，PLS—DA）。

2 结果

显微镜检查结果：与对照组相比，烧死组肺脏组织支气管黏膜上皮杯状细胞增多，黏液分泌增加，支气管黏膜充血，细胞核固定呈栅栏状排列（图1）。

图1 支气管黏膜上皮组织（HE×40，标尺长度：25 μm）

比较烧死组与对照组平均光谱，与对照组相比，烧死组酰胺Ⅰ带宽度增加且吸收峰高度较低（图2A）。 烧死组和对照组光谱数据经二阶导数变换处理后，酰胺Ⅰ带、酰胺Ⅱ带呈现多个蛋白质二级结构吸收峰。 对照组支气管上皮的光谱特征在1 651cm-1和1 547cm-1附近， 而烧死组支气管上皮的光谱特征是在1 689cm-1和1 624cm-1附近。（图2B）。

图2 烧死组与对照组平均光谱和二阶导数变换后吸光度的比较

为进一步观察蛋白质二级结构的变化，对二阶导数光谱进行PCA 分析。 图3 为PC1 和PC2 得分散点图，图中横坐标表示每个样本第一主成分得分值， 纵坐标表示每个样本的第二主成分得分值，前两个主成分的累计可信度已达78.84 %。 PC1、PC2的得分散点图显示，烧死组分布在y 轴的左侧，对照组分布在y 轴右侧，且两组样本间没有出现重叠。 此外，从样本分布的疏密程度来看，对照组样本分布相对集中，烧死组样本更加分散（图3A）。 PC1 的载荷因子图显示， 沿着PC1 1 624 cm-1和1 689 cm-1对烧死组光谱贡献比较大，在1 651 cm-1和1 547 cm-1对于对照组贡献比较大（图3B）。

十折交叉验证结果显示，当潜变量为3 的时候，交互验证的校正标准偏差值最小，确定最佳潜变量数为3（图4A）。使用3 个潜变量用于建立初始PLS 模型。 PLS-DA 内部交叉验证对烧死组预测结果显示，烧死组样本分布在预测值1 周围，对照组样本分布在0 周围，并且烧死组样本全本分布在红色分界线以上，分类准确率为100 %（图4B）。

图3 PCA 结果

图4 交叉验证结果

3 讨论

烧死是法医鉴定工作中较为常见的一种死因，然而，受火灾现场的复杂性和破坏性以及其他因素影响，常规辅助检查方法受到限制，为法医工作者带来了巨大挑战。 因此，烧死尸体的鉴定和研究仍需一种更加简便、可靠的手段。 致死性烧伤支气管皮上皮可表现出生活反应，如热呼吸道综合症，显示呼吸道黏膜凝固性坏死，细胞核变长呈栅栏状排列等。 可见图像提供关于细胞形态学变化的信息，但没有分子信息。 而FTIR 显微光谱技术可以精确检测生物组织中的化学组分及分子结构，并且操作简单，检测效率高，已被广泛地应用于生物医学、食品工业、药品检测等多个领域。 本研究的目的是利用FTIR 技术结合化学计量学方法，对烧死与非烧死尸体肺组织特征光谱进行比较分析，力图寻找一种新的方法，为烧死和死后焚尸的法医学鉴定提供科学支持。

本研究选取光谱指纹区波段1 800～1 000 cm-1进行数据分析。 酰胺Ⅰ带为最常用的蛋白质分析带，一般在1 650 cm-1附近，几乎完全由肽腱的C=O伸缩振动产生。 酰胺I 带的吸收光谱通常是相同的，并且对蛋白质构象的改变特别敏感[20]。本实验中烧死组和对照组平均光谱在酰胺Ⅰ带峰形具有明显差异，峰高偏差和变形表明蛋白质结构发生明显变化，这可能是由于热作用导致的支气管上皮细胞蛋白变性[21-22]。二阶导数变换是解决谱带重叠的常用方法，其中负峰直接与非衍生谱的中心峰对齐[23]。 二阶导数变换后烧死组在酰胺I 带附近出现1 624、1 659、1 689 cm-1三个特征性吸收峰，三个特征峰所对应的蛋白质二级结构分别为β-折叠、α-螺旋、β-转角，在酰胺II 带附近出现1 547cm-1对应的蛋白质二级结构为α-螺旋[24]。说明了烧死肺组织确实存在客观的改变。 有研究利用红外光纤传感器探测热变性过程中牛血清白蛋白的二级结构，发现变化主要是随着温度升高α-螺旋逐渐减少，β-转角和β-折叠增多[25]。

PCA 是一种无监督的统计方法，经常被用来分析数据集之间的差异和相似性，能够将高维度数据转换为低维，同时保留最重要的分类信息，分类结果通过样本在一组正交的主成分上投影来表示[26]。本实验PCA 结果显示，烧死组和对照组样本点沿着PC1 完全分开，PC1 占总变异的71.94 %，可表征大部分的数据特征。 从样本分布的疏密程度来看，对照组样本分布相对集中，表明所有正常组织的化学成分更加相似，而烧死组样本光谱分布更加分散，表明烧死组样本支气管上皮组织差异较大，原因可能是支气管黏膜所受的损伤程度不同。 与主成分相关联的载荷因子反映变量对PCA 的贡献度[27]。 PC1的载荷因子1 624 cm-1（β-折叠）和1 689 cm-1（β-转角）对PCA 贡献较高，且烧死组呈正相关；1 651cm-1和1 547 cm-1（α-螺旋）同样对PCA 有较高贡献度，但是与对照组呈正相关，而与烧死组呈负相关。 这表明烧死和非烧死组样本中的蛋白质二级结构含量存在显著差异， 这是光谱数据分类的客观依据。这些蛋白质二级结构的变化可能与焦耳热引起的蛋白质变性有关，随着温度升高α-螺旋逐渐减少，β-转角和β-折叠增多[28]。 本研究展示了FTIR 光谱结合化学计量学识别致死性烧伤支气管上皮蛋白质结构变化的能力，进一步反映了其对烧死支气管上皮细微分子变化的高敏感性。

PLS-DA 是一种具有偏最小二乘回归性质的有监督分类技术，是有效的多元分类手段，以一组测量数据为基础，利用偏最小二乘回归的预测值来实现分类[29]。 利用PLS-DA 对烧死组和对照组63 条训练集样本光谱进行判别分析。 在模型建立前，关键的一步是潜变量的选取，潜变量是原始变量的线性组合，可以用来描述一组解释变量（即，光谱数据的矩阵）。潜变量若选择过少模型会出现欠拟合，选择太多会引入噪声，模型会出现过拟合[30]。 通常采用交叉验证进行潜变量数的选取[31]。因此，本研究应用10 个交叉验证组执行交叉验证，最终选取3 个潜变量用来建立PLS-DA 预测模型。 本实验中烧死组和对照组样本被准确的识别，模型分类准确率达到100%。评价判别模型的最好方法是对模型进行外部验证，但由于实践中样本量不足，本实验只选用内部交叉验证的方法来验证模型性能。 所以，下一步研究需要收集更多的样本，提高该模型的预测能力。

综上所述，本研究初步探讨了烧死和非烧死尸体支气管上皮组织的光谱学变化，并通过PCA 分析了烧死组与对照组之间的差异，建立了PLS-DA 判别模型，对烧死样本进行分类，为下一步模型参数的优化以及烧死样本的预测奠定了基础，为烧死案件的法医学鉴定提供科学依据，也为其他死因的法医学研究提供了参考。