中风1号对急性期脑出血大鼠Bcl-2、Bax蛋白表达的影响*

梁 群 王 丛 朱永志△

（1.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨 150040）

脑出血属于中医出血性中风范畴［1］。如何降低脑血管疾病的死亡率和致残率一直是医学界要攻克的重点。随着医学界的专家们对急性脑血管疾病的不断探索，应用中医中药治疗急性脑出血逐渐受到国内外专家的重视，临床研究也显示疗效显著［2-4］。中风1号为本文通信作者朱永志教授总结四十余年治疗急性期脑出血经验形成的方剂，主要功效为活血化瘀。脑出血多为瘀阻脑窍，瘀血在急性期不除反而阻碍脑组织血运循环使致残率增加。前期动物实验发现中风1号可以减轻脑水肿、保护神经组织［5］，为中医内科保守治疗急性脑出血奠定了基础。本次实验研究将在前期研究的基础上进一步明确中风1号治疗急性期脑出血的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级别SD雄性大鼠40只，许可证号 SCXK（京）2016-0006，体质量 180～220 g，由黑龙江中医药大学动物实验中心代为购买。普通专用饲料喂养于温度（22±4）℃，相对湿度40%～70%，自然光线的实验室，经过1周的适应性饲养后进行实验。本实验严格遵守动物福利与伦理原则，在黑龙江中医药大学实验动物管理和使用委员会监督下进行，伦理号2017092001。

1.2 试药及仪器 1）试剂：兔抗大鼠Bcl-2、Bax多克隆抗体购自Abcam公司；即用型快速免疫组化Max VisionTM试剂盒及 DAB显色试剂购自北京中杉金桥生物技术有限公司。2）药物：中风1号（组成：水蛭10 g，生大黄10 g，泽泻15 g，三七粉10 g，生地黄15 g。由黑龙江中医药大学附属第一医院制剂室熬制），按动物体表面积比率换算大鼠灌胃量，常规水煎至3.5 g/mL（每毫升含生药3.5 g）。阿莫西林钠舒巴坦钠（哈药集团生产，批号17070703-2），甘露醇（石家庄四药有限公司生产，批号1709130503）。3）仪器：大小鼠脑定位仪（上海玉研科学仪器有限公司生产）、脑立体定位进样针（上海玉研科学仪器有限公司生产）、动物颅骨钻（上海玉研科学仪器有限公司生产）、切片机 （德国莱卡生产）、超净工作台（苏净安泰生产）、光学显微镜（日本奥林巴斯公司生产）。

1.3 分组及造模 SD大鼠40只随机分为4组，每组10只，分别为假手术组、模型组、中风1号组、甘露醇组。除假手术组外，其余大鼠参照文献［6］的方法制备模型。用10%水合氯醛按大鼠体质量计算麻醉药用量进行腹腔注射麻醉。大鼠俯卧位固定于立体定位仪上，充分暴露囟门消毒备皮后切开大鼠头顶部正中线皮肤约1 cm，暴露骨膜及前囟点，在前囟点右侧3.5 mm，后0.2 mm处用牙科钻钻出直径约1.0 mm的圆孔，深达硬脑膜表面。同时鼠尾用酒精消毒，距尾末端3 cm处剪断用微量注射器抽取50 μL血液，把微量注射器固定在立体定位仪上，针头沿钻孔进针约6 mm，以20 μL/min速度将50 μL血液缓慢推进脑组织，留针观察约5 min后缓慢出针。在留针期间包扎大鼠尾部伤口。取适量牙科水泥用纯净水调成糊状封闭颅骨创口，待牙科水泥略干后缝合头皮并用碘酚局部消毒，可在伤口表面撒适量抗生素以防止感染影响指标变化。假手术组：动物接受与模型组相同的操作但脑组织不注血。

1.4 给药方法 在造模后2 h大鼠完全苏醒后开始计时，中风1号组每日2 mL中药汤剂（剂量约为成人用量的1倍）灌胃，假手术组、模型组每日等量生理盐水灌胃，甘露醇组给予大鼠尾静脉注射甘露醇0.5 g/（kg·d），共给药 3 d。

1.5 标本采集与检测 给药3 d后，大鼠吸入麻醉后颈椎离断处死，开颅取脑，以针道为中心，前后各移动2 mm切取4 mm厚脑组织。将切片浸于二甲苯中脱蜡0.5～1 h，乙醇脱水（步骤为 100%乙醇 5 min、100%乙醇5 min、95%乙醇5 min、80%乙醇5 min），蒸馏水冲洗。在室温下切片，用3%甲醇双氧水封闭20～30 min，自来水冲洗；采用高压修复之后放入PBS中。然后用免疫组化笔将组织圈住，切片上滴加山羊血清封闭液，保持在室温20～30 min。甩去多余液体，不洗，再在切片上滴加目的一抗，4℃过夜，次日取出来后待切片恢复至室温后，放入PBS洗3次，每次5 min。切片上滴加二抗，37℃避光20 min后，放入PBS中洗3次，每次5 min，然后滴加DAB染液显色5～10 s，水洗终止显色。最后采用苏木素复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，封片完成。选择各组的阳性和阴性组织相进行显微照相；选择各组有意义的组织相进行读取分析，最后存盘。显微镜下Bcl-2和Bax阳性反应物在胞浆或胞核有棕色颗粒者为阳性细胞，计数阳性细胞。

1.6 统计学处理 应用SPSS19.0统计软件。计量资料以（±s）表示，符合正态分布的采用独立样本t检验，不符合的用秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

见表1，图1，图2。假手术组3 d后仅有少量Bcl-2、Bax阳性细胞，与假手术组比较其余各组血肿周围脑组织Bcl-2、Bax阳性细胞数均明显增多。模型组Bc1-2蛋白、Bax蛋白与中风1号组、甘露醇组比较差异均具有统计学意义（P＜0.05）。中风1号组与甘露醇组Bcl-2/Bax比值远大于1，中风1号组与甘露醇组比较治疗效果更显著（P＜0.05）。

表1 各组 Bcl-2及 Bax阳性细胞数比较（个，±s）

表1 各组 Bcl-2及 Bax阳性细胞数比较（个，±s）

与模型组比较，*P＜0.05；与甘露醇组比较，△P＜0.05

组 别 n Bcl-2/Bax Bcl-2 Bax假手术组 10 1.03±0.03模型组 10 0.79±0.06甘露醇组 10 1.30±0.74*1.75±0.64 1.70±0.82 23.00±3.38 29.50±4.38 30.80±4.16* 23.40±2.91*中风 1号组 10 1.75±0.26*△35.60±2.37*△ 20.70±1.70*△

图1 各组大鼠脑组织Bax蛋白的表达（免疫组织化学法，400倍）

3 讨 论

图2 各组大鼠脑组织Bcl-2蛋白的表达（免疫组织化学法，400倍）

脑出血一直是临床上的常见病，因其发病率和致残率均很高，造成的家庭负担较重，故受到医学界的广泛重视。经多年研究，中医药治疗脑出血逐渐得到医学界的认可。中医理论中认为出血性中风为血不循经、血溢脉外引起的离经之血积蓄于脑［7-8］，血不循经可因气虚不固摄血液、肝阳上亢等多种因素引起，以往一致认为急性期脑出血应用活血化瘀药物会加重出血或引起再出血，所以以前活血化瘀一直是急性期脑出血的治疗禁区［9］。但随着医学界对脑出血的不断研究与探索发现：但凡血液不能滋养周身，溢出脉外，即使是鲜血亦都归属于瘀血范畴，即“离经之血即为瘀”［10-12］。

朱永志教授根据多年临床经验认为脑出血的形成即为瘀血阻滞于脑络，离开经脉循行的血液就已经成为瘀血。瘀血贯穿于出血性中风的始终［13］。所以在脑出血急性期辨证用药时活血化瘀为针对其病因病机用药，加之合理的君臣佐使相配伍能共同达到救治目的。朱永志教授一直从事中医神经内科疾病的研究工作，在应用中医中药治疗神经系统疾病尤其是出血性中风的研究及诊治方面积累了丰富的临床资料和宝贵经验。中风1号是朱永志教授依据多年临床经验总结出的中药汤剂，其由水蛭、生大黄、泽泻、三七粉、生地黄组成。其中水蛭功擅破血、逐瘀消癓。大黄取其活血祛瘀之效用于血热妄行致血不归经出现的脑出血。泽泻可利水渗湿泄热，减轻脑水肿降低颅内压。三七粉化瘀止血使瘀血不留于络。生地黄清热养血，养阴生津。水蛭为君，生大黄为臣，其余为佐使药，诸药共奏活血祛瘀之功效。

本实验在大量临床观察基础上验证中风1号治疗急性期脑出血的作用机制。当急性脑出血发生时脑组织处于缺血缺氧状态，Bc1-2和Bax会保护性增高［14］。但Bax的高表达会抑制Bc1-2的表达而加重脑组织损伤［15］。本实验研究通过自体尾静脉注血制作大鼠急性脑出血模型，通过3 d的给药发现，中风1号可使脑组织缺血缺氧改善，Bc1-2表达增加而Bax表达减少，Bc1-2/Bax值增加。证实中风1号可通过调控脑出血大鼠细胞凋亡基因减轻脑出血后的神经损伤，为临床上中风1号治疗急性期脑出血提供依据，再次证实中药可以治疗急危重症。