线粒体DNA的发现及其基因组的揭示过程

任衍钢 白冠军 宋玉奇 路彦文

（阳泉师范高等专科学校 山西平定 045200）

早在1890年，德国科学家奥尔特曼（Altmann R.）观察并首次提出线粒体是真核生物的细胞器，猜测线粒体具有遗传自主性［1］。20世纪50年代，线粒体被确定具有细胞质遗传特性；60年代，线粒体DNA 分子（mtDNA）被发现；70年代及80年代初，科学家逐渐开始了对线粒体基因组的研究；90年代至今，基因组的研究成果被不断地应用于病理、系统发育等方面，成为生物学和医学中的重要研究领域之一。本文着重从线粒体遗传现象的发现、线粒体DNA 的发现和线粒体基因组的揭示3 个方面进行历史简述。

1 线粒体遗传的发现

线粒体遗传属于非孟德尔遗传。自从1909年柯伦斯（Correns C.）和鲍尔（Baur E.）各自独立地发现了叶绿体的非孟德尔遗传现象后，线粒体的遗传就受到了关注。由于线粒体小于质体，故其研究难度大于质体。1934年，戈尔德施密特（Goldschmidt C.）［2］根据其研究成果推测，吉普赛蛾的颜色差异的原因可能与线粒体有关。1940年，“酵母遗传之父”的丹麦科学家温厄（Winge O.）和劳斯特森（Laustsen O.）［3］推测，近亲繁殖二倍体酵母退化的现象与线粒体遗传有关。用酵母菌研究线粒体的优势在于，酵母菌是单细胞真核生物，生命周期短，适合经典遗传学分析，且能在基本培养基上培养。除此之外，酵母菌的线粒体虽然一般比植物细胞的小，但一般要比动物细胞的大，数量比动物细胞的少，易用显微镜进行观察。1949年，埃弗吕西（Ephrussi B.）［4］发现一种由突变导致的厌氧型小群落酵母的遗传与细胞质有关，而不是与细胞核有关；不久，斯洛尼姆斯基（Slonimski P.）和埃弗吕西［5］进一步证实，这种突变与线粒体有关。1950年，我国科学家陈士怡［6］（1912—1994）在其导师埃弗吕西指导下首次发现，酵母菌中存在细胞质基因。1950—1952年，米切尔（Mitchell M.B.）等也发现粗糙脉孢菌线粒体的形成不符合孟德尔遗传规律，这种生长缓慢型粗糙脉孢菌的遗传与线粒体有关。需要指出的是，在20世纪50年代之前，尽管人们发现了线粒体的遗传与细胞核无关，但是由于学者［例如，哈维（Harvey E.）用海胆卵和佐林格（Zollinger H.）用小鼠肾小管等］用实验证明这些细胞在线粒体被除去或破坏后，可以再生线粒体，故人们普遍认为线粒体是通过细胞其他结构的改变而产生的。甚至60年代初，仍有人用实验推断线粒体来自核外的其他膜系统［7］。可见，线粒体内存在基因的事实并没有因为发现线粒体属于细胞质遗传而被普遍认可。

2 线粒体DNA 的发现

随着电子显微镜的使用和分子生物学的诞生，线粒体的相关研究取得了重要的进展。1952年，高分辨率的电子显微镜的使用，取代了詹纳斯绿染色，作为显示线粒体的首选方式。分子生物学的一系列发现促进了科学家寻找线粒体基因的存在。最初，曾有科学家依据酵母菌线粒体细胞质遗传的特点和50年代关于质粒的研究成果，提出了类似病毒寄生宿主细胞的“侵入”假说，还依据草履虫遗传的研究成果提出了类似草履虫遗传的假说，甚至依据发现一些病毒中的遗传物质是RNA而不是DNA，曾猜想线粒体内也含有像病毒RNA那样的遗传物质。为了证实这些假设，科学家开展了一些实验，但都无果而终［8］。20世纪50年代和60年代初，虽然没有找到在酵母菌中存在DNA的直接证据，但在动物的线粒体中却找到了。1956—1957年间，切夫雷蒙特（Chevremont J.）及其同事在用脱氧核糖核酸酶（DNase）处理成纤维细胞线粒体时发现，线粒体内的某种物质会发生阳性反应，由此猜想线粒体内有DNA 存在，但这是在特殊条件下才得到的孚尔根阳性反应，不能令人信服。1963年，在瑞典大学实验生物学研究所工作的M·纳斯（Nass M.）和S·纳斯（Nass S.）［9］通过线粒体内纤维固定和电子染色反应的方法，用电子显微镜观察到在小鸡胚胎细胞线粒体中存在具有DNA 特性的丝状纤维，这些丝状纤维类似于细菌、蓝藻的核质。他们的发现引起了科学界的关注，被认为是首次证实线粒体中存在DNA 分子。尽管如此，酵母菌仍然是研究线粒体DNA 的重要生物。1962年，四柳（Yotsuyanagi Y.）［8］用电子显微镜观察发现，酵母菌中一些涉及到呼吸变异的类型主要与线粒体有关，与它们是否处于有氧或无氧的环境无关。他用电子显微镜观察到，一些进行无氧呼吸的较小的酵母菌，其线粒体内膜缺乏像野生酵母菌那样的“脊”，这无疑就将线粒体结构改变与呼吸能力联系在一起。1964年，沙茨（G.Schatz）等用氯化铯密度梯度离心法发现，酵母菌线粒体的核酸存在于DNA 卫星带中（这是因为酵母菌线粒体中在碱基组成上比染色体具有更丰富的A、T 碱基），再次证实了线粒体DNA（mtDNA）的存在。既然线粒体中存在DNA 分子，下一步就是探讨mtDNA 分子是否含有基因的问题了。1966年，芒诺卢（Mounolou J.）［10］等通过线粒体浮力密度的特殊变化，鉴定了符合非孟德尔遗传的酵母菌的一个呼吸缺陷突变是由mtDNA的改变引起的。他们选取了均具有mtDNA 分子的野生型（大型）酵母和突变的小型酵母，先鉴定了单倍体的小型酵母的mtDNA 分子与大型的mtDNA分子在碱基组成上存在差异；然后通过野生型与突变型杂交形成二倍体酵母菌，再通过减数分裂分离成单倍体酵母，证实了大型和小型的差异与其呼吸能力直接相关。紧接着，1967年，昆泽尔（Kuntzel H.）和诺尔（Noll H.）从脉孢菌线粒体中发现了类似于细菌的核糖体［也有报道说是线粒体核糖体是由奥布赖恩（O′ Brien T.W.）和卡尔夫（Kalf G.F.）在研究小鼠肝细胞中发现的［11］］。正是这些发现推动了美国生物学家马古利斯（Margulis L.）于1967年重新提出更有说服力的线粒体起源的内共生学说。1969年，2 个实验室都独立地发现，用环己酰亚胺阻断粗糙脉孢霉菌线粒体和酵母菌线粒体外的核糖体后，应用脉冲标记方法发现了线粒体能制造蛋白质［7］。补充说明，环己酰亚胺抑制细胞质基质中蛋白质的合成，但不抑制线粒体中蛋白质的合成。需要指出的是，虽然在20世纪60年代初中期，线粒体中DNA 的存在被证实并获得了广泛认可，但mtDNA 是否有自己的遗传信息表达和蛋白质合成体系，还不能被完全确信，因为以前有人报道过在电子显微镜下找不到线粒体的现象。据此还有人认为，mtDNA 可能会像噬菌体一样能整合到细胞核DNA 中。直至20世纪60年代末，科学家才证实，过去认为的线粒体丢失，只是由于用常规的电子显微镜难以检测到而已。到20世纪70年代，通过对酵母菌mtDNA 突变的研究才解决了过去认为mRNA 是从细胞核导入的问题［7］。

3 线粒体基因组的揭示与应用

随着线粒体DNA 被学术界所公认，1968年，托马斯（Thomas D.Y.）和威尔基（Wilkie D.）等很快就用经典遗传学的方法绘制了酵母菌线粒体基因图。1969年，“线粒体遗传学”正式在澳大利亚的堪培拉召开的会议上确立。1975年，莫洛伊（Molloy P.L.）等发表了酵母线粒体基因组序列图：“线粒体生物合成的抗生素抗性标记基因在酵母菌较小的突变体缺失分析”。这个序列虽然是一个粗的酵母mtDNA 基因组草图，但意味着揭开了研究线粒体基因组的序幕［12］。从1974—1976年，一些实验室开始使用限制性内切酶在特定的地方剪切DNA，这种方法的使用导致酵母和其他一些物种包括人类（智人）的mtDNA 图谱得以开启。1976年，斯里普拉卡什（Sriprakash K.）等［13］首先用这种方法完成了酵母mtDNA 的遗传和物理图谱。1977年，道格拉斯（Douglas M.）和布托（Butow A.）等发现一些多肽是由mtDNA 翻译的。1978年，鲍思（Bos J.L.）和斯洛尼姆斯基（Slonimski P.）发现，一些线粒体基因是“中断的”（不连续）的。1979年，马卡奇尼（Maccecchini M.L.）和纽珀特（Neupert W.）等对大量的细胞质合成的线粒体蛋白质的前体进行了鉴定。到70年代末，线粒体基因组的基础工作已基本完成。

20世纪80年代是人类线粒体基因组研究领域取得重大突破的时代。1981年，剑桥大学的亨森（Hensgens）小组在英国《自然》杂志上公布了人类线粒体基因核苷酸的完整序列和密码子的特征，这个序列被称之为“剑桥序列”（CRS）。这个序列共有16 569 个碱基对（bp），除了同启动DNA 有关的D 环区（D-loop）外，只有87 个bp 不参与基因的组成。现在使用的人类mtDNA 序列是它的修订版（rCRS）。1987—1988年又是人类线粒体研究作出重大突破的2年，这2年发生了2 个引起学术界关注的事件。一是1987年，华莱士（Wallace D.）首先提出mtDNA 可能引起人类疾病，这被认为开辟了医学遗传学研究的新领域。次年（1988年），他又最先发现mtDNA 第11 778 位点的G—A 使NADH 脱氢酶亚单位（ND4）的蛋白质中第340 个氨基酸由精氨酸变成组氨酸。致盲率50%的Leber氏遗传性视神经病变（LHON）就是由该位点引起的。他被公认为是首次发现了人类mtDNA 缺失和点突变的学者，当然也是首次对线粒体疾病进行分子鉴定的科学家，他还在研究LHON 的基础上提出了线粒体病的概念［14］。此后对线粒体缺陷引起的疾病的研究如雨后春笋般地爆发。到2016年，至少有275 种线粒体疾病被鉴定［15］。二是以威尔逊（Wilson A.）为首的美国加州大学伯克利研究组根据对祖先来自非洲、欧洲、亚洲及新几内亚和澳大利亚土著共147 名妇女胎盘细胞mtDNA的分析，提出了生活在地球上的现代人类的共同祖先是大约15 万年前生活在非洲的一个妇女。这就是学术上有较大争论，后来被称之为“线粒体夏娃”的假说。与核遗传比较，线粒体基因组具有进化快、丰度高，遗传模式简单和具有保守紧凑的结构特点（例如细胞色素C 氧化酶I 亚基COI基因），这对研究生物的进化具有重要的意义。由于mtDNA 对人类的重要性，研究人员将线粒体基因组称之为人类的第25 号染色体（人类基因组的结构：22+X+Y+mtDNA）。

进入20世纪90年代后，线粒体基因组测序工作全面展开。1996年第1 个真核生物——酿酒酵母的核基因组的完全测序得以完成，2年以后又确定了酵母菌线粒体基因组的完全测序［16］。1996年，科学家在美国加利福尼亚州圣克拉拉埃菲迈克斯公司的协助下，研发出首个线粒体微观测序仪。这个仪器有大约25 美分硬币大小的硅芯片，通过退火印刷处理，存储了高达135 000 种DNA 序列片段，其全面性包括了大多数单螺旋mtDNA。同年，在田纳西州的韦尔（Ware P.）案中，mtDNA 首次被作为破案的证据，应用mtDNA 分析指正韦尔犯有强奸和杀人罪。1997年第1 个植物——拟南芥的线粒体基因组的测序得以完成［17］。

进入新世纪后，mtDNA 在疾病的诊治与防治、法医学鉴定、遗传学及系统发育学等方面的应用更加显著。在家谱分析方面，2009年，专家应用mtDNA 分析对沙皇尼古拉二世进行了遗体的确认并破解了他的小女儿阿纳斯塔西娅去向之迷（读者可阅读这方面的有关资料）。2013年，英国查理三世国王的遗体也是通过比对他的mtDNA与他妹妹2 个母系后代进行鉴定的。2016年，一种被称作线粒体捐赠或线粒体替代疗法（MRT）的体外受精技术首次应用，它通过从供体母细胞产生mtDNA，并从母本和父本的细胞核DNA 中产生后代。在纺锤体转移过程中，一个卵子的细胞核被插入至一个已除去细胞核的卵子的细胞质中，但仍含有供体女性的mtDNA，然后使新卵子与精子受精。该程序能使线粒体基因有缺陷的母亲生育一个线粒体健康的后代。墨西哥的一对夫妇用这种技术生了一个男孩。截止到2015年，有人统计Mitochondrial DNA杂志上收录的文章中相关报道可达上千篇，众多生物的线粒体基因组图谱已经被绘制［18］。

综上所述，线粒体基因的发现和揭示经历了线粒体遗传现象的发现、线粒体DNA 的发现和线粒体基因组的揭示与应用的过程。从中可以看到，对线粒体基因的认识并不是一蹴而就的，而是经过了一个反复质疑和论证的过程。在对线粒体遗传的认识中，模式生物酵母菌扮演了至关重要的角色。人类线粒体基因组的揭示为人类诊断、诊治线粒体疾病，探讨人类进化及法医鉴定等方面开拓了广泛领域，但是其开发和利用还远远不够，尤其是对一些线粒体疾病的发现和诊治仍具有更广泛的前景。