生乳中硝酸盐还原菌的筛选及系统发育分析

王慧敏，王利，粘靖祺

（黑龙江省完达山乳业股份有限公司，哈尔滨 150078）

硝酸盐、亚硝酸盐作为食品护色剂、防腐剂被广泛应用于腌腊、酱卤、肉灌肠、发酵肉制品等食品中，以增强和改善肉制品的色泽，延长保存时间。硝酸盐在一定条件下可被还原为亚硝酸盐，但鉴于过量的亚硝酸盐对人体有一定危害，所以国家对硝酸盐、亚硝酸盐使用量和亚硝酸盐的残留量都做出了严格的限制。硝酸盐、亚硝酸盐虽可以作为食品添加剂，但在乳制品中是严禁使用的。牛乳中的亚硝酸盐来源就成为控制的关键。我国国家标准对乳粉中的亚硝酸盐含量做了限量规定，其含量（以NaNO2计）不得大于2mg/kg[1]。乳制品中亚硝酸盐的来源有多方面因素，一是自然界广泛存在这种化合物，因此，哺乳动物的乳汁分泌和形成过程中就已含有此类物质；如有研究报道，对6只大鼠舌表面细菌进行计数、分离、纯化，从中发现4个属的具有硝酸盐还原性的优势菌[2]。二是硝酸盐和亚硝酸盐的转化。自然界中确实存在一些微生物具有将硝酸盐还原成亚硝酸盐的能力。董竞等[3]从侗族酸肉中筛选出9株具有硝酸盐还原能力的菌株，其中2株硝酸盐还原能力较高；何燕飞等[4]从浙江省特色腌鱼制品中也分离出两株硝酸盐还原菌菌株。乳制品中含有丰富的含氮有机物，其在微生物的作用下可逐渐分解成氨，氨可进一步被微生物转化为硝酸盐和亚硝酸盐，硝酸盐在一定条件下亦可还原为亚硝酸盐。因此，如能有效控制生乳中的相关微生物，对亚硝酸盐的控制可以起到辅助性作用。

本试验以生乳中的微生物为研究对象，对生乳中的硝酸盐还原菌进行了分离、纯化，进而进行分子生物学鉴定，以期为控制乳制品生产中由硝酸盐还原菌引起的质量风险提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与培养基

生乳样品：混合生乳样品。

PCA培养基[5]：胰蛋白胨5.0g，酵母浸膏2.5g，葡萄糖1.0g，琼脂15.0g，将上述成分溶于1 000mL蒸馏水中，煮沸溶解，调节值pH至7.0±0.2，分装于适宜的容器中，121℃高压灭菌15min。

磷酸盐缓冲液：磷酸二氢钾（KH2PO4）34.0g，蒸馏水500mL，pH7.2；贮存液：将34.0gKH2PO4溶于500mL蒸馏水中，用大约175mL的1mol/LNaOH溶液调节pH值，用蒸馏水稀释至1 000mL后贮存于冰箱；稀释液：取贮存液1.25mL，用蒸馏水稀释至1 000mL，分装于适宜的容器中，121℃高压灭菌15min。

MPC琼脂培养基[6]：胰蛋白胨5.0g，酵母浸膏2.5g，葡萄糖1.0g，无抗脱脂奶粉1.0g，将上述成分溶于1 000mL蒸馏水中，用15%NaOH溶液调节pH值至7.0±0.1。加入琼脂10～15g，煮沸使琼脂融化。必要时使用两层纱布（夹脱脂棉）过滤，分装于适宜的容器中，121℃高压灭菌15min。

DTA培养基：胰蛋白胨10.0g，葡萄糖5.0g，2%溴甲酚紫乙醇溶液2mL，将上述成分溶于1 000mL蒸馏水中，用15%NaOH溶液调节pH值至6.9±0.1。加入琼脂10～15g，煮沸使琼脂融化。分装于适宜的容器中，121℃高压灭菌15min。

硝酸盐还原培养基[7]：蛋白胨1.0g，NaCl 0.5g，KNO30.1～0.2g，pH7.4，分装于试管中，121℃高压灭菌15min。

1.2 方法

1.2.1 生乳中微生物的分离

以无菌吸管吸取25mL混合生乳样品至盛有225mL磷酸缓冲液的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成10-1的样品匀液。用1mL无菌微量移液器吸取10-1样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于盛有9mL磷酸缓冲液的无菌试管中，振摇试管，制成10-2的样品匀液，以此方法配制10-1～10-6的稀释液，每递增稀释一次，换用一次无菌微量移液器吸头。各取1mL均匀涂布于PCA平板中，平行涂布3板；同时，分别吸取1mL磷酸缓冲液加入两个无菌平板中作为空白对照，36±1℃培养48±2h。

嗜冷菌分离：取各梯度稀释液1mL均匀涂布于MPC平板中，平行涂布3板；同时，分别吸取1mL磷酸缓冲液加入两个无菌平板中作为空白对照，于6.5±0.5℃培养10d，培养皿堆叠不超过6个。

需氧芽孢菌分离：将混合生乳样品经80℃加热处理10min，按上述方法制成10-1～10-6的稀释液，取各梯度稀释液1mL均匀涂布于MPC平板中，平行涂布3板；同时，分别吸取1mL磷酸缓冲液加入两个无菌平板中作为空白对照，36±1℃培养48±2h。

嗜热芽孢菌分离：将混合生乳样品经100℃加热处理30min，按上述方法制成10-1至10-6的稀释液。取各梯度稀释液1mL均匀涂布于DTA平板中，平行涂布3板；同时，分别吸取1mL磷酸缓冲液加入两个无菌平板中作为空白对照，55±1℃培养48±2h。

待长出明显菌落后，从最高稀释倍数的平板中挑取单个菌落，以平板划线的方式多次纯化，镜检，初筛分离出菌落形态不同的纯化菌株。

1.2.2 硝酸盐还原菌的筛选

将分离纯化的菌株接种于装有硝酸盐还原培养基的试管中，每个菌株接种2支并编号，保留2支空白试管作为对照，37±1℃培养48±2h。观察结果时，在试管中加入几滴Griess试剂，若出现红色，则说明具备硝酸盐还原性；如未变红，在对应编号的另一支试管中加入锌粉，摇动，37℃培养30min，加入Griess试剂，出现红色，证明培养基中的硝酸盐仍然存在，如不出现红色，则说明硝酸盐已被进一步还原。以此方法筛选出具备硝酸盐还原能力的菌株。

1.2.3 硝酸盐还原菌的分子生物学鉴定

变性：从培养基中挑取菌体于50μL TaKaRa（宝生物）微生物直接裂解 PCR缓冲液中，变性后离心取上清液作为模板，反应条件80℃，15min。使用TaKaRa（宝生物） 16S rDNA 细菌鉴定 PCR 试剂盒扩增目的片段。取变性反应液1μL，PCR预混液25μL，上、下游引物各0.5μL(20pmol/μL),定容至50μL。反应条件：94℃预变性5min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1.5min，循环30次；72℃终延伸5min。

使用TaKaRa （宝生物）MiniBEST 琼脂糖凝胶DNA提取试剂盒切胶回收目的片段进行DNA测序，然后在GenBank中比对。

2 结果与分析

2.1 硝酸盐还原性测试

通过硝酸盐还原试验，分离出具备硝酸盐还原能力的菌株5株，如图1所示，编号为BA-1、BA-2、BA-3、BA-4和BA-5。

图1 硝酸盐还原显色反应

2.2 分子生物学鉴定

将菌株BA-1、BA-2、BA-3、BA-4、BA-5的PCR产物，各取5μL进行3%琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示。

图2 3%琼脂糖凝胶电泳图

将菌株BA-1、BA-2、BA-3、BA-4、BA-5的16S rDNA测序结果和GenBank已发布的菌株进行同源性比较，构建系统发育树。

系统发育树（系统进化树）是研究生物进化和系统分类中常用的一种树状分枝的图形，树枝上的数字表示bootstrap验证中该树枝可信度的百分比，用来概括表示各种（类）生物之间的亲缘关系。构建系统发育树需要做Bootstrap检验，一般Bootstrap值大于70，认为构建的进化树较为可靠。当Bootstrap值过低时，所构建的进化树其拓扑结构可能存在问题，进化树不可靠。

通过对鉴定结果进行分析，结果如图3所示：

图3 相关菌株序列的16S rDNA基因序列的邻接法系统发育树[原始树（original tree），结点处数值为bootstrap值，括号外为序列登录号]

采用Mega3.1软件的邻接法构建系统发育树，由系统进化树（图3）和序列同源性比对（表1）可知，在系统进化树上，BA-1、BA-3、BA-4与蜡样芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌聚在一起；BA -2与波茨坦短芽孢杆菌聚在一起；BA -5与luciferensis芽孢杆菌聚在一起。

表1 序列同源性比对表

一般认为，16S rDNA序列同源性＞99%，可以认为属于同一个种；16S rDNA序列同源性＜97%，可以认为属于不同的种；16S rDNA序列同源性小于93%，可以认为属于不同的属。

3 结论

由以上结果可以看出：生乳中存在可以将硝酸盐还原为亚硝酸盐的微生物，BA-1、BA-3、BA-4为蜡样芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌；BA-2为波茨坦短芽孢杆菌；BA-5为芽孢菌属细菌。

从健康的奶牛乳房中刚挤下的牛乳中微生物数量极少，但由于挤乳的操作过程、器具、空间环境、贮存条件等因素都能增加生乳中的微生物种类和数量，且生乳中含有丰富的营养，在适宜的温度条件下，微生物可快速繁殖。生乳中微生物的种类和数量可以通过加强乳牛场和乳品加工厂的日常卫生管理，实行有效的冷却处理和预杀菌工艺等措施加以控制和降低。降低生乳中的微生物数量，对生乳品质的提升至关重要。此外，鉴于微生物的分离、筛选具有随机性，生乳中可能还存在其他具备硝酸盐还原能力的微生物，对此还有待研究。