管花肉苁蓉药渣中多糖含量测定及抗氧化活性研究

杨 婷， 艾拉旦·麦麦提艾力， 陶义存， 姚 军

(新疆医科大学药学院， 乌鲁木齐 830011)

管花肉从蓉[Cistanchetubulosa(Schenk)R．Wright]为列当科(Orobanchaceae)肉苁蓉属(CistancheHoffing．etLink)植物，主产于我国新疆，在于田、民丰县有大面积栽培，具有补肾精、益精血、润肠道的功效[1-3]。研究表明管花肉苁蓉中含有苯乙醇苷类、环烯醚萜类、木质素类、多糖类及生物碱类等多种生物活性成分[4]，具有抗氧化、增强机体免疫力、保护肝脏、改善大脑记忆力等药理作用[5-9]。本研究采用水提醇沉法提取管花肉苁蓉药渣中的多糖成分，采用蒽酮硫酸法测其多糖含量，运用红外光谱技术对多糖结构进行初步鉴定，通过3种抗氧化模型测定多糖的抗氧化活性，现报道如下。

1 材料与方法

1.1仪器FA1004型分析天平(上海友声衡器有限公司)，T6新世纪型紫外-可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)，tige-21型红外分光光度计(日本岛津公司)。

1.2试剂无水葡萄糖(天津市永大化学试剂有限公司，批号：20130225)，95%乙醇(天津市富宇精细化工有限公司)，蒽酮(国药集团化学试剂有限公司，批号：20170420)，浓硫酸，二苯代苦味酰基(DPPH，上海梯希爱化成工业发展有限公司)，新亚铜(上海梯希爱化成工业发展有限公司)，醋酸铵(天津市盛奥化学试剂有限公司，批号：20130412)，硫酸铜(天津市盛奥化学试剂有限公司，批号：20141103)，氢氧化钠(天津永晟精细化工有限公司)，过氧化氢(天津市盛奥化学试剂有限公司)，试剂均为分析纯。

1.3药材管花肉苁蓉药渣2018年5月购买于新疆金骏阳光生物科技有限公司。

1.4方法

1.4.1 管花肉苁蓉中药渣中多糖提取方法 将管花肉苁蓉药渣粉碎，用95%乙醇回流脱脂，在80℃的条件下按照料液比(1∶10)回流提取2次，每次2 h，在80℃的条件下合并滤液浓缩，用95%乙醇醇沉，4℃过夜。

1.4.2 多糖含量测定方法 称取葡萄糖样品20.0 mg于50 mL容量瓶中，制成0.4 mg/mL的葡萄糖标准溶液，分别吸取3、4、5、6、7 mL置于50 mL容量瓶，定容至刻度，分别吸取各个浓度梯度的葡萄糖溶液2.0 mL于试管中，另取等量蒸馏水作空白对照，在各管加入0.2%硫酸蒽酮(称取0.1 g蒽酮加入50 mL浓硫酸)4.0 mL，用沸水加热15 min，取出用冷水冷却至室温，在620 nm处测其吸光度值，以吸光度(A)为纵坐标(Y)，葡萄糖浓度(C)为横坐标(X)，绘制标准曲线，得回归方程Y=16.45X-0.202 4(R2=0.991 1)。吸取管花肉苁蓉药渣中粗多糖溶液2.0 mL于10 mL具塞试管中，按上述方法测定样品溶液中多糖含量。

1.4.3 红外光谱分析 将多糖与溴化钾按1∶100的比例均匀混合，充分研磨，取适量用压片机压片，在4 000～400 cm-1范围内进行红外光谱扫描，对多糖结构进行初步鉴定。

1.4.4 管花肉苁蓉药渣中多糖的抗氧化活性研究

1.4.4.1 DPPH自由基清除能力测定 称取40 mg DPPH试剂，用无水乙醇溶解定容于250 mL容量瓶内，配置成浓度为2×10-4mol/L的溶液。取5支具塞试管依次加入不同浓度的样品溶液各2 mL及2×10-4mol/L的DPPH溶液，加入1 mL无水乙醇使反应总体积为5 mL，摇匀，避光放置30 min，在517 nm处测定吸光度(Ai)，按公式DPPH清除率/%=A0-(Ai-Aj) /A0×100%(式中：A0为无水乙醇2 mL+DPPH2 mL+无水乙醇1 mL时的吸光度值；Aj为无水乙醇2 mL+待测样品2 mL+无水乙醇1 mL时的吸光度值；Ai为待测样品2 mL+DPPH2 mL+无水乙醇1 mL时的吸光度值)计算清除率，以Vc为阳性对照，每组实验重复3次，求平均值。

1.4.4.2 铜离子还原能力测定 取0.5 mL 不同浓度的样品液，分别加入0.01 mol/LCuSO4和7.5 mmol/L新亚铜试剂各0.125 mL混合，再加入0.2 mol/L pH值为7.0的NH4Ac缓冲液至总体积为1.0 mL，摇匀，静置30 min，在450 nm波长处测定吸光度，按公式相对总还原百分率/%=(A-A0)/(Amax-A0) ×100% (式中：A0为不加样品时的吸光度值；Amax为在系列样品溶液中溶液浓度最高时的吸光度值；A为样品在450 nm处的吸光度值)计算还原百分率。以Vc为阳性对照，每组实验重复3次，求平均值。

1.4.4.3 羟自由基清除能力测定 取5支具塞试管依次向其中加入2.0 mmol/L的FeSO4溶液2.0 mL，1.0 mmol/L的H2O22.0 mL，振荡，摇匀，再加入6.0 mmol/L水杨酸3.0 mL，摇匀，于37℃水浴加热15 min，在510 nm处测定吸光度(A0)，然后分别向5支试管中加入待测样品0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，再分别加入超纯水0.8、0.6、0.4、0.2、0 mL，摇匀，37℃下水浴加热15 min，在510 nm处测定吸光度(AX)，按公式·OH自由基清除率/%=(A0-AX)/A0×100%计算清除率。以Vc为阳性对照，每组实验重复3次，求其平均值。

2 结果

2.1管花肉苁蓉药渣中多糖的含量按“1.4.2” 项下方法测定管花肉苁蓉药渣中多糖含量为0.025 mg/g。

2.2管花肉苁蓉药渣中多糖结构分析在4 000～650 cm-1有多糖类物质的特征吸收峰，在3 500～3 200 cm-1处有1个强和宽的吸收峰，为多糖上·OH的吸收峰。在2 910 cm-1处出现的峰为C-H的变角振动，和C-H伸缩振动形成的糖类特征吸收峰。在1 604 cm-1处出现的峰为C-O吸收峰，在840 cm-1处出现的峰为α-型糖苷键的特征吸收峰，说明提取物为α-多糖。以波数为横坐标(X)，透过率为纵坐标(Y)绘制红外光谱图，见图1。

图1 管花肉苁蓉药渣多糖的红外光谱图

2.3管花肉苁蓉药渣中多糖体外抗氧化活性当多糖浓度为0.04 mg/mL时,对DPPH自由基清除率为59%，相同浓度阳性对照品Vc的清除率为89%;当多糖浓度为0.03 μg/mL时,对铜离子总还原百分率为64%，相同浓度阳性对照Vc的还原率为88%；当多糖浓度为0.015 mg/mL，对·OH自由基清除率为60%，相同浓度阳性对照Vc的清除率为70%，见图2-4。

图2 管花肉苁蓉药渣中多糖浓度与·OH自由基清除率

图3 管花肉苁蓉药渣中多糖浓度与DPPH自由基清除率

图4 管花肉苁蓉药渣中多糖浓度与铜离子还原能力

3 讨论

目前对管花肉苁蓉的研究主要集中在其醇提物的化学成分及药理作用方面，如苯乙醇苷类在体外对黑色素瘤细胞抑制率达到90%以上，对人体内黑色素瘤生长的抑制率达到50%以上,对管花肉苁蓉水提物的研究主要在多糖成分的提取和含量测定[10-14]。本研究对管花肉苁蓉药渣进行二次利用，从药渣中提取多糖类成分，提高了管花肉苁蓉药材的利用率，通过3种抗氧化模型研究管花肉苁蓉药渣中多糖成分的抗氧化活性，为更好地开发利用管花肉苁蓉多糖的生物活性打下了实验基础。