恙虫病致病机制及辅助检查研究进展

李柏成 张剑锋

广西医科大学1研究生院，2第二附属医院急诊科（南宁 530021）

恙虫病东方体（Orientia tsutsugamushi，Ot）为专性细胞内寄生微生物，感染后存在于内皮、树突、巨噬、分叶核白、淋巴等细胞中，免疫机制复杂，涉及固有、细胞、体液等免疫系统[1]。我国恙虫病以Gilliam型为主，其次为Karp型，Kato型罕见；国外如孟加拉国恙虫病基因型包括Karp型、Gilliam型、Kato型和ta763型样菌株，以Karp样菌株为主[2]。不同菌株和不同地区的Ot抗原性和毒力存在差异，导致恙虫病在我国不同地区及人群的流行病学有所差异。而且恙虫病的临床特征无特异性，人类普遍易感，对不同基因型无交叉免疫力[3]，世界各地均有散发甚至爆发流行，少部分患者无焦痂表现，外斐试验阳性率逐渐降低。因恙虫病致病机制尚未完全明确，辅助检查无特异性，导致该病的预防和诊断仍面临较大困难，出现多器官功能衰竭可增加死亡风险，给临床救治带来巨大困难，严重威胁人类生命安全。故本文就恙虫病的致病机制及诊断措施进行综述，为诊疗提供科学依据。

1 恙虫病的致病机制

1.1 免疫机制目前多数人认为内皮细胞（endothelial cells，EC）是恙虫病感染的主要靶点，而EC功能障碍是患者严重恙虫病的标志。也有人认为Ot可以使用两种NK效应器来调节核转录因子-κB（nuclear transcription factor-κB，NF-κB）p65核转运和抑制NF-κB转录激活，其感染的主要细胞是巨噬细胞[4]。SOONG等[5]研究认为免疫和血管功能障碍与恙虫病发病机制相关，特别是感染引起中枢神经系统改变导致大脑皮层和小脑的病理改变，出现脑膜炎和局部出血性病灶的弥漫性反应，可增加感染恙虫病小鼠的死亡率。在恙虫病小鼠模型中，感染引发的EC损伤和IL-33介导的在定向感染过程中，其病理变化为EC应激和活化增加导致IL-33显著增加，从而使疾病严重程度及致死率增加[6]。另外，EC产生的IL-1α、IL-6、IL-8、IL-10、IL-15、TNF-α、TNF-β等细胞因子和 CCL2、CCL17等趋化因子可引起局部炎症反应[7]。

皮肤感染Ot会系统性地扩散到大量器官，并引发器官特异性炎症，有研究利用共聚焦成像技术，在肺的单细胞水平检测到Ot，但主要靶细胞是巨噬细胞而不是EC。肺和脑浸润的免疫组化分析显示，不同部位的病变组织结构不同，在浸润实质结节内常可见表达肌动蛋白的巨噬细胞，在这些器官的血管周围病变中少见。免疫组化定量分析显示浸润巨噬细胞在肝脏、心脏、肺和大脑中的反应早晚不同，其中巨噬细胞在肝脏中激活的时间较早[8]。采用酶免疫法测定急性期和恢复期恙虫病患者的血浆活化白细胞黏附分子（activated leukocyte cell adhesion molecule，ALCAM）、血管细胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）、可溶性血红蛋白清道夫受体（soluble haemoglobin scavenger receptor，sCD163）、可溶性 CD14（soluble CD14，sCD14）、人软骨糖蛋白39（human cartilage glycoprotein 39，YKL-40）和巨噬细胞移动抑制因子（macrophage migration inhibitory factor，MIF）水平。结果发现与健康人群不同的是，恙虫病患者在急性期以上所有介质的水平明显升高，而且在随访期间，其ALCAM、VCAM-1、sCD14和YKL-40的水平仍较高。高血浆ALCAM、VCAM-1、sCD163、sCD14、MIF，特别是YKL-40均与疾病严重程度相关，其中ALCAM、sCD163、MIF，尤其是YKL-40与死亡率明显相关。上述结果表明恙虫病以单核细胞/巨噬细胞和内皮相关标志物水平升高为特征，监测炎症标志物特别是YKL-40，有助于判断疾病的严重程度和预测临床结果[9]。

1.2 细胞免疫Th1型免疫反应对Ot抗原有重要防御作用，间皮、树突、吞噬细胞等抗原提呈细胞产生IL-12，可引起Th1细胞反应，导致IFN-γ产生，早期IL-10的产生可阻断这种Th1细胞反应，IL-10抑制包括IFN-γ、IL-1、IL-2、IL-3、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、TNF-α等Th1细胞因子的产生，从而抑制清除EC内感染的Ot[10]。人类自然杀伤T细胞（humans naturally kill T cells，NKT）在感染性疾病中作为调节和（或）效应细胞，在恙虫病患者中，循环NKT细胞在数值上得到保留，但功能受损，病情缓解后功能障碍可逐渐恢复。研究[11]证明NKT细胞的增殖及其产生干扰素γ和IL-4的能力在恙虫病患者中明显低于健康人群。恙虫病患者的CD69、程序性死亡受体-1（programmed death receptor-1，PD-1）、淋巴细胞激活基因-3（lymphocyte activation gene3，LAG3）、T细胞免疫球蛋白域和粘蛋白域包含分子-3的表达水平显著升高。在缓解期，NKT细胞的CD69、PD-1、LAG3、T细胞免疫球蛋白黏液素3表达升高，增殖受损，IL-4产量下降。循环黏膜相关恒定T细胞（mucosal-associated lnvarlant T cells，MAIT）和NK细胞水平可反映恙虫病的严重程度，MAIT被激活，数值不足，功能受损以及NK细胞被激活、数值增加和受损的TNF-α MAIT细胞CD69的表达升高，其产生大量的受损细胞肿瘤坏死因子以及干扰素γ刺激IL-12后，会加重恙虫病发生发展[12-13]。在恙虫病感染过程中，T细胞免疫有助于抵抗Ot，但CD8+T细胞对保护和发病机制的作用尚不清楚。有学者[14]对Karp菌株接种的BALB/c小鼠模型进行研究，认为CD8+T细胞在急性和持续性感染期间可抑制Ot的生长，并且可保护BALB/c小鼠免受致命性感染。亦有研究证明免疫CD8+T细胞在Ot感染宿主免疫应答中起主要作用，而免疫CD8+T细胞耗尽的脾细胞对预防Ot感染的作用较弱[15]。

1.3 体液免疫恙虫病致病机制还可能与某些免疫蛋白起靶点作用有关。ScaA作为细菌黏附因子，抗ScaA抗体能发挥显著中和宿主细胞的细菌感染作用。有研究[16]亦证明ScaA免疫在小鼠致命性恙虫病感染中有保护作用，它不仅对同源菌株的致命性提供保护性免疫，而且当与恙虫病外膜蛋白TSA56结合时，对外源菌株也具有显著的保护作用。结合重组56-kDa蛋白抗原，与血清抗体对Ot四种最流行的菌株（Karp、Kato、Gilliam和TA763）均表现出广泛的反应性。有研究[17]用点酶联免疫吸附法对急性期恙虫病患者标本进行检测，其敏感性为98.5%，特异性为96.3%，阳性预测值为86.7%，阴性预测值为99.6%，可证明56-kDa蛋白在人类免疫系统中被识别，但作用机制有待进一步明确。恙虫病患者急性期细胞因子网络会发生显著变化，大多数炎症标志物在血浆中升高，但是血小板来源的介质如正常T细胞激活分泌调节因子（normal T-cell expressed and secreted，RANTES）明显减少，某些炎症标记物，包括各种趋化因子（如IL-8、单核细胞化学引诱物peptide-1和巨噬细胞炎性protein-1β）和下游炎症标记（c反应蛋白和pentraxin-3），也与该疾病的严重程度和死亡率有关。多种介质的失调水平，增强的炎症因子可能导致疾病的不同严重程度和临床结果[18]。在恙虫病并发脑炎的患者中检测脑脊液生物标志物时发现，白蛋白指数和胶质纤维酸性蛋白水平有所升高，但不如细菌性脑膜炎、结核性脑膜炎升高显著；使恙虫病脑炎可与其他疾病引起的严重神经系统受累引起的脑炎相区别[19]。

2 恙虫病的诊断方法

2.1 传统检查有研究证明恙虫病并发2个或以上脏器、系统损害，发生率为89.1%[20]，有82%的患者出现肾功能异常，61%的患者出现尿常规异常，血尿阳性（55%）和微量血尿（16%）是最常见的[21]。尿常规、肾功能等检查对发现恙虫病合并急性肾损伤有重要意义。生化检查如嗜酸性粒细胞比例或计数降低，丙氨酸氨基转移酶、门冬氨酸氨基转移酶浓度升高、电解质紊乱等有助于恙虫病的诊断；其中白细胞增高、血小板降低为重症恙虫病的危险因素[22]。部分地区恙虫病骨髓象特点表现为粒系、红系、巨核系细胞增生活跃，成熟粒细胞中可出现中毒颗粒，巨核系细胞增生伴成熟障碍，也可出现异型淋巴细胞比例增高及噬血现象；有78.7%的患者可合并低钙血症；嗜酸性粒细胞计数为0时对恙虫病的诊断有一定的提示意义[23]。另外，白细胞、甘油三酯、肝酶、C反应蛋白、钾离子、蛋白尿、肌酐等是恙虫病患者出现MODS的危险因素，可增加1～4倍的风险，以上指标异常对提示恙虫病易发生MODS，动态监测检验项目对临床治疗及预后有重要参考价值[24]。

肺部损害为恙虫病最常见的器官损害，心脏损害会增加患者死亡率，其中窦性心动过缓是恙虫病的常见心电图表现，可见于50.0%以上的患者[25]。肝脾及淋巴结肿大儿童比成人多见，心电图、胸片或CT、超声等影像学对恙虫病并发症如心律失常、肺部感染、肝脾情况评估有重要意义，为首选的无创检查。对于骨髓穿刺活检、血气分析等有较大佐证作用，可及时发现呼吸衰竭、嗜血细胞综合征等情况。部分患者会出现罕见并发症如胰腺炎、消化道出血、DIC等，行血尿淀粉酶、胃镜、血清铁蛋白等检测也非常有必要。目前外斐试验阳性率较低，对诊断恙虫病无特异性且敏感性较低，因此对恙虫病的诊断只能作为参考指标[26]。

2.2 降钙素原（procalcitonin，PCT）血清PCT作为感染性指标在临床上较常应用，实践证明血清PCT水平与恙虫病的病情严重程度呈显著正相关，可作为评估恙虫病患者病情严重程度的生物标志物[27]。采用PCT检查对早期诊断恙虫病也具有较高的诊断价值，并可通过监测患者PCT水平的变化，评估恙虫病患者的治疗效果[28]。PCT清除率在48和96 h检查时，对严重脓毒症患者具有较好的预后预测价值[29]，恙虫病为现代发生脓毒症常见疾病之一，对临床感染患者及时行PCT检查有助于恙虫病的诊疗。C反应蛋白、PCT炎症水平可随病情加重呈不断升高趋势，CRP、PCT联合D-二聚体检测有利于恙虫病并发器官损伤患者的治疗及预后判断，三者可作为其临床预后评估指标[30]。重症恙虫病PCT水平显著高于非重症患者，差异有统计学意义，前者更容易出现双肺受累及胸腔积液并发症，而且治疗退热的时间需要更长[31]。

2.3 基因测序免疫荧光技术或基因诊断在实验室运用较多，但随着科学检查技术的发展，有研究在3例恙虫病患者中，均采用免疫荧光技术确诊，并提示恙虫病IgM效价为1∶80的诊断价值更大[32]。国内学者亦认为通过免疫荧光技术检测Ot、Ot IgM为确诊恙虫病的关键[33]。在分子和基因诊断方面，目前认为取焦痂标本用于恙虫病的分子诊断和基因型特征，在感染早期，焦痂检测应优先作为诊断样本而非全血[34]。近期，基因测序方法的不断发展，新型高通量定量PCR筛选方法测定恙虫病临床分离的菌株药敏在临床上得到较好运用[35]。有实验研究收集临床诊断恙虫病患者标本906份，其中220份经巢式聚合酶链式反应检测阳性率为24.3%，包括Karp型138株、Kato型29株、Gilliam型39株和TA763型13株等[36]，由于恙虫病基因型复杂和突变、新型菌株出现等原因，其阳性率亦不高，且特异性和敏感性有待进一步研究认证。本院近年来也有1例恙虫病合并急性肾损伤患者，应用华大基因感染病原高通量基因检测出Ot 7个序列数，最后单予多西环素治疗好转出院。基因测序是对发热原因不明及无焦痂等方面体征而考虑恙虫病疾病的患者，在无特异性特征情况下或已经完善常规检查后仍无法明确诊断时，可作为最后确诊的有效方法。因为基因分子辅助检查费用昂贵，且目前尚无大规模应用于临床，常在试验研究中运用较多，需要广泛推广，不管是医疗机构还是政府，均尚有大量工作任务。

3 总结与展望

综上所述，Ot感染过程中宿主与病原的相互作用涉及体液和细胞免疫的结果，受多种细胞、分子、炎症因子等影响，免疫反应调控机制极其复杂。DAAZ等[37]阐释表明宿主-病原体在恙虫病感染靶细胞中相互作用，为完成其复制周期，恙虫病可感染多种细胞，根据感染阶段和感染组织器官的不同而表现出不同的趋向性。目前国内外仍需加大对恙虫病致病机制的不断研究，进一步阐明其发病机制，为恙虫病流行防治提供科学依据。恙虫病传统和现代的辅助检查综述表明，现有技术方法的敏感性和特异性均不高，相关生物学指标物对疾病诊断和预后有提示及评估作用；基因分子技术的广泛应用有可能成为未来临床诊断恙虫病更为有效的方法。