口腔微生物与阿尔茨海默病相关性研究进展

尹晶菊，葛颂

(1 遵义医学院，贵州遵义563000；2 遵义医学院附属口腔医院)

人类口腔中已经定植超过700种不同的微生物，如细菌、病毒、真菌等。口腔是人体五大菌库之一。口腔微生物有众多栖息地，如舌、颊、牙龈、龈沟、腭及唾液等，这些栖息地在年龄、口腔卫生状况、氧化还原电位及宿主的免疫反应等方面存在差异，因而也造就了口腔微生物组成的多样性。阿尔茨海默病(AD)是一种慢性神经退行性疾病，是老年痴呆最常见的形式，其临床表现在于记忆减退、行为改变和不能进行正常的日常活动。该疾病首要的病理特征是细胞外淀粉样蛋白β(Aβ)聚集形成的老年斑(SP)、细胞内Tau蛋白过度磷酸化(p-Tau)形成的神经原纤维缠结(NFTs)以及大面积神经元的丢失或损伤[1]。研究发现，口腔微生物在AD的发病机制中可能充当启动器或辅助因子的作用，一方面可激活神经胶质细胞，引发大脑内炎症；另一方面可与机体相互作用诱发Aβ、p-Tau的形成和(或)积聚，由此导致AD的发生、发展。现将口腔微生物与AD的相关性综述如下。

1 细菌

1.1 牙周致病菌 研究发现，与AD相关的一些重要的牙周病原体有牙龈卟啉单胞菌(Pg)、福赛坦菌(Tf)、具核梭杆菌(Fn)、中间普菌(Pi)和齿垢密螺旋体(Td)，其中Pg、Td、Tf具有免疫力库，可以规避宿主的免疫监视得以存活和生长，并创建和维持炎症毒性环境[2]。研究认为，牙周致病菌可能通过以下3种机制影响AD[3，4]：①牙周病原体以及病原体相关分子模式[脂多糖(LPS)、肽聚糖、鞭毛蛋白等]与宿主反应提高促炎细胞因子水平，大量炎性细胞因子进入全身循环，增加全身炎症负担，这可能使神经胶质细胞激活导致神经元破坏、损伤。Stein等[5]检查AD患者中牙周细菌的血清抗体水平，发现在认知障碍之前，患者体内牙周细菌的抗体水平升高数年。Ishida等[6]研究发现，与对照APP-Tg小鼠比较，接种Pg的APP-Tg小鼠海马和皮质内Aβ40和Aβ42水平更高，脑组织中IL-1β和TNF-α表达升高，并且认知功能显著受损，表明牙周致病菌所诱发的宿主反应可能促进AD发生或进展。②存在于牙菌斑生物膜中的细菌和(或)毒力因子可直接通过血流、周围神经等侵袭大脑。Poole等[7，8]在一次人体死后12 h研究中显示，Pg连同Td、Tf及其组分在10例AD脑组织中被鉴定，并证实在4例AD病例脑组织中存在Pg的LPS。随后，该课题组进行动物实验，使12只Apo E-/-小鼠口服感染Pg、Td、Tf和Fn作为单一和多种微生物感染，在慢性感染12、24周后处死；结果发现，除了Fn单一感染小鼠外，所有小鼠脑组织中均分离出细菌基因组DNA，通过测序扩增产物证实了感染期间细菌侵入大脑，并证实了小鼠大脑中存在Pg细菌基因组DNA并激活补体级联。③牙周病原体LPS可能诱导炎症细胞浸润到脑血管内，造成血管内皮损伤、血小板积聚及血栓形成等，间接造成神经元损伤。另外，Canobbio等[9]也提出，血小板的积聚可能促进淀粉样前体蛋白(APP)、Tau蛋白形成，使APP衍生出的Aβ也增加，从而促进AD的发生、发展，反过来增多的Aβ也可能加剧血小板的活化，使活性氧簇生成增多，促凝血表型增加等。由此可见，牙周病原体和(或)毒力因子可能到达AD患者大脑，它所引发的脑血管病变也可能促进AD进展。

1.2 螺旋体 螺旋体是具有内鞭毛的螺旋形革兰阴性细菌，具有强亲神经性，可引起慢性持续性感染。Miklossy等[10～12]系列研究发现，使用暗视野显微镜检查发现螺旋体存在于14例AD患者的血液、脑脊液(CSF)和脑组织中，但在13例对照样本中均未发现；并在AD脑组织中螺旋体(口腔和非口腔)检测出率比非AD对照组高约8倍。另外，Riviere等[13]研究发现，AD脑样本中分离出Td的频率高于非AD脑样本约4倍，并在三叉神经节、脑桥、海马中发现了2种类型的密螺旋体抗原。这些说明螺旋体可能通过三叉神经进入脑部，从而诱发或加重AD。

1.3 幽门螺旋杆菌(Hp) 作为一种弯曲的螺旋形革兰阴性菌，Hp在口腔中普遍存在。Hp可能通过口-鼻-嗅神经途径或破坏血脑屏障进入大脑，从而引发神经变性[14]。Roubaud Baudron等[15]评估受试者血清样本中Hp感染率，发现391位(64.8%)受试者血清Hp阳性，并且感染者痴呆患病率较高；经过20年的随访，发现痴呆病例148例，在控制混杂因素后，确定Hp感染是发生痴呆的危险因素。Kountouras等[16]从AD患者和非AD受试者的胃黏膜取样，前者Hp感染的组织学检出率明显高于年龄匹配的非AD受试者。动物研究同样也支持AD和Hp感染之间的关联。Wang等[17，18]研究表明，腹腔注射Hp滤液可导致大鼠的空间学习和记忆缺陷、海马树突棘成熟异常以及大鼠海马和皮质中早老素2和Aβ42增加以及p-Tau的形成。尽管上述研究均支持的是胃部Hp感染与AD相关，但有学者提出口腔是Hp除胃以外另一个重要的储蓄池，且口腔内Hp感染率显著高于胃部[19]。另外，也有大量研究证实在行牙周基础治疗后，患者Hp复发率降低及根除率升高，这从侧面反映出口腔Hp的存在在一定程度上可能影响胃部Hp感染和再感染。再考虑到口与胃距离脑部的距离，因此口腔Hp感染相对于胃部Hp感染来说可能更能促进AD的发展。

2 病毒

2.1 单纯疱疹病毒1型(HSV-1) HSV-1是一种嗜神经病毒，可经过口腔、呼吸道、生殖器以及皮肤破损处侵入体内，潜居于人体正常黏膜、血液、唾液和三叉神经节等部位中。研究发现，病毒可通过周围神经系统或嗅觉束重新激活并进入大脑，HSV-1在大脑中潜伏，但可能会随着压力、免疫抑制、应激、外周感染或脑中的炎症等因素周期性地重新激活，再活化的病毒通过直接侵袭或氧化应激作用导致Aβ的沉积和p-Tau蛋白形成，其最终形成SP和NFTs；并且，APO Eε4等位基因也可能影响脑内病毒，加重其再激活程度[20，21]。IgM的存在，是病毒原发性感染活化或复活的标志[3]。Lovheim等[22]的一项纵向研究包括3 432位受试者，平均随访时间为11.3年，表明血清样品抗HSV IgM抗体阳性使发展为AD的风险加倍。Mancuso等[23]研究轻度AD患者的血清抗HSV-1 IgG滴度和通过MRI测量皮层灰质容量显示，与年龄匹配的健康对照相比，升高的抗HSV-1 IgG滴度(>75%)在AD中更为常见，这与皮层双侧颞侧和眶额叶灰质体积呈正相关，从而为HSV-1感染作为AD 的病因提供支持。Martin等[24]检测HSV-1感染期间小鼠的三叉神经节和大脑皮层中神经炎症和神经变性标志物，目的是找到HSV-1再激活的证据；最后，他们不仅在感染的急性症状阶段，而且感染后60 d，在无症状潜伏期开始之后检测到病毒性ICP4蛋白；表明病毒发生了再激活，重新激活伴随着Toll样受体4(TLR-4)、IFN-α/β、p-IRF、p-Tau等标志物的上调。这些证据支持HSV-1在大脑中反复激活的假设，通过触发TLRs途径，干扰APP新陈代谢来促进神经炎症，因此可能带来神经变性风险。

2.2 巨细胞病毒(CMV) CMV是一种β疱疹病毒，在免疫活性正常的宿主中可引起持续性终身无症状感染；与HSV-1一样，CMV可能在免疫缺陷或其他条件下重新激活[20,25]。Carbone等[26]研究了一组老年患者，发现在5年随访期内发生临床AD者的基线CMV IgG抗体水平显著高于对照组。Lurain等[25]分析AD患者的血清、CSF及冷冻保存的淋巴细胞，发现CMV抗体水平与NFTs相关；超过80%CMV血清阳性受试者的CSF中存在IFN-γ，但对照人群中未检测到，且CSF 中IFN-γ水平与NFTs显著相关；此外，在CMV血清阳性的外周循环中，衰老T细胞(CD4+或CD8+CD28-CD57+)的百分比与阴性细胞相比显著升高。很遗憾，这项研究没有证实CMV存在于AD患者的大脑中。然而，这些研究结果支持 CMV感染可诱发特异性T细胞免疫应答，使促炎细胞因子增多，从而使Aβ、NFTs沉积，可能是AD的一个潜在风险因素。

2.3 人类疱疹病毒6型(HHV-6)和EB病毒(EBV) HHV-6也具有嗜神经性，可在脑中潜伏感染。Lin等[27]研究了50例AD患者的大脑样本，发现约70%的额颞区皮质样本中含有 HHV-6，与年龄匹配的35例正常脑样本中仅40%含有 HHV-6。Carbone等[26]发现，AD患者外周血白细胞(PBL)样本中HHV-6阳性率23%，对照人群仅4%；对一组老年人进行5年随访，发现基线水平上PBL HHV-6 DNA阳性与认知能力下降和AD发展相关。

EBV也是疱疹病毒家族中的一类，在口咽部上皮细胞内增殖并可长期潜伏在人体淋巴组织中，当机体免疫抵抗力下降时，EBV病毒可再激活引发感染。Carbone等[26]检测来自AD组和非AD对照组的PBL和大脑样本中EBV DNA的存在，结果发现AD患者PBL中EBV DNA阳性率(45%)显著高于对照组(31%)，受试者均发现APO Eε4阳性；5年随访期内，发生AD的一组老年人中基线PBL EBV DNA阳性和血清EBV IgG抗体水平显著增加。虽然，目前关于EBV、HHV-6与AD关系的研究有限，但以上研究均表明该病毒可能是老年人认知功能恶化和AD进展的危险因素之一。

3 真菌

研究发现，与AD相关的口腔真菌有白假丝酵母菌(Cal)、热带假丝酵母菌 (Ctr)、光滑假丝酵母菌等，均是条件致病菌，通常在病弱个体中具有致病性，或者局部因素有利于其生长。Pisa等[28]使用免疫组织化学法分析AD患者额叶皮层的组织表明，脑组织内存在包含Cal在内的多种真菌；同一研究组，提取AD脑样本利用真菌DNA序列鉴定真菌物种，发现包括Cal、Ctr在内的多种真菌在脉络丛、内嗅皮层/海马、外部额叶皮质等区域存在感染；并且，两项研究也均发现在脑毛细血管中也有此现象。因为大多数AD患者的中枢神经系统中表现出血管损伤，并有高达90%的AD患者出现各种脑血管病变，Aβ在脑毛细血管、中小动脉壁的沉积是明显的。因此推测，血管中存在的真菌感染，可能会诱发Aβ沉积和血管病变，从而引发AD。

综上所述，口腔微生物可能通过全身循环、神经通路及其他途径间接或直接加重脑组织炎症，引发神经变性，因此在AD发展过程中的作用不可忽视。大量证据表明，牙周致病菌、螺旋体、HSV-1与AD密切相关，但仍未明确两者间的因果关系。虽然，如CMV、HHV-6、EBV为非口腔常驻微生物，但从口腔微生物组学观念来看，三者虽以低丰度的形式展现，但也可对疾病产生不可估量的影响。再者，鉴于AD脑中存在微生物的多样性，是否有其他口腔细菌、真菌或病毒也附着在AD患者脑中以螺旋体为主的生物膜上，或者AD患者脑中存在由不同口腔微生物形成的多种生物膜，仍有待深入研究。而另一方面，由于多种口腔微生物感染可能导致对AD治疗的更高抗性和造成更严重的痴呆，因此充分认识口腔微生物与AD之间的联系，可为AD发病机制、风险预警及疗效预测相关研究提供依据。