根系活力检测中保险粉用量的确定

段 慧，李弈仙，魏永胜，康靖全

(西北农林科技大学 生命科学学院，陕西杨凌 712100)

植物根系的活力是植株吸收、合成和生长的综合表现，影响整株植物的生长发育和产量形成。根系不仅起到固定与支持作用，同时也为整个植株尤其是地上部分提供生长发育所必需的水、矿质、氨基酸和激素(如脱落酸和细胞分裂素)等物质。因此，在植物相关研究中，无论是农林草[1-6]、园林植物[7]还是生态学领域[8-9]，根系活力都是常用的反映植株生活力的重要生理指标。根系活力与呼吸密切相关，因此可采用甲烯蓝吸附、α-萘胺氧化和TTC(2,3,5-三苯基氯化四氮唑，2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride，C19H15N4Cl，相对分子质量为334.81)还原法，或伤流液质量[10-11]和同位素示踪[12]等方法。其中TTC法因为准确、重现性好而被广泛使用[13]。TTC是标准氧化还原电位为80 mV的氧化还原物质，被还原后即生成红色而不溶于水的三苯基甲月替 (1,3,5-triphenylformazan， TPF) 。利用比色法，在485 nm检测乙酸乙酯中TPF含量，以单位时间根质量还原的TTC量反映根系活力(μg 或mg·g-1·h-1)。作为一种定量评价根系活力的指标，测定过程需要建立TPF标准曲线。其原理是利用保险粉(连二亚硫酸钠，Sodium hydrosulfite，Na2S2O4，相对分子质量为174.10)还原TTC生成红色的TPF，再利用乙酸乙酯萃取TPF，进而制作成含有不同量的TPF乙酸乙酯溶液建立标准曲线。其中保险粉的加入量在理论上应该是过量的[14]，不足则显色淡，导致根系活力测定结果被高估，但保险粉加入过多，与TTC反应所剩余的部分会在乙酸乙酯中形成不溶黏性物影响最终的比色结果。那么，保险粉的适宜用量应该是多少呢？为此，笔者查阅了高等教育出版社和科学出版社等9家出版单位的23部植物生理学实验指导(或教程)。TPF标准梯度溶液建立的方法可归纳为2种，一种是分别在装有不同浓度的TTC溶液的6～7个试管中加入少量保险粉，每个试管约2 mg，并保持一致[15-16]；另一种是先在已知浓度的TTC溶液中加“少许”(没有给出具体质量)保险粉，产生TPF并用乙酸乙酯定容后形成TPF母液，再分别吸取不同体积的TPF母液用乙酸乙酯定容至10 mL建立TPF标准梯度溶液[17-18]。对于第1种，在实际操作过程中称取保险粉2 mg需要使用百万之一天平，而多数科研实验室和普通教学实验不具备条件，即使具备条件，操作中也很困难，2 mg的保险粉是否达到过量的要求也不明确。如果不称量则和第2种方法一样，无法确定具体质量，更无法保持各试管中加入量的一致性。生理学实验指导(或教程)是实验教学和科学研究中相关指标测定的方法来源，指导书中的错误会导致错误的实验或测量结果，在实验教学中则误导学生，在科学研究中得到错误的结论。因此，需要对已经公开发表的科学文献进行检测，以确定是否因方法不正确产生了错误的结果，并通过试验，确定保险粉的适宜用量，以期为根系活力相关的研究和教学提供科学的理论支持。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

主要试剂有保险粉(天津市标准科技有限公司)、TTC(上海远帆助剂厂)和乙酸乙酯(浙江双林化工厂)，均为分析纯。称量采用瑞士普利赛斯Precisa 十万分之一电子天平(EP225SM-DR)，比色采用日立紫外分光光度计(U-3900H)，15 mL具塞刻度试管及100 mL 容量瓶。

1.2 试验设计与数据采集

试验设计的保险粉目标用量分别为0.02、0.04、0.06、0.1、0.12、0.15和0.20 g，每个目标量称取2份(重复)，记录实际值(保留5位小数)。分别放入14 支试管中，各加5 mg·mL-1TTC溶液(0.499 64 g TTC蒸馏水定容至100 mL， 0.5 g·mL-1) 5 mL[15]，摇动，生成TPF后各加乙酸乙酯10 mL，充分振荡后避光静置4 h后比色。为避免比色杯的影响，比色过程中只使用2支比色杯，一支用于纯乙酸乙酯为对照，另一支用于样品液，每次比色时用1 mL样品液润洗比色杯2次。

2 结果与分析

2.1 根系活力研究的文献计量结果

由于所查阅的实验指导书介绍的标准曲线均难以操作，因此推测以TTC法测定根系活力的研究结果会有很大的偏差。为了验证推测，进行文献计量分析。在中国知网(CNKI)中国期刊全文数据库农业科技和生物学专辑中，以(摘要=根系活力)(精确匹配)为检索条件共检索到5 699 篇文献，其中标题=根系活力的共319篇，采用TTC法(全文=TTC)的55篇，α-萘胺法25篇，伤流液法29篇。抽样提取了中国农业科学、农业工程学报、林业科学、园艺学报、草业学报和生态学报等杂志中25篇研究文献根系活力结果(表1)，涉及小麦、玉米、水稻等作物。数据显示，根系活力平均值最高为350 mg·g-1·h-1[6]，而最低的仅为4.4 × 10-4mg·g-1·h-1[19]，最高平均值是最低平均值的约80万倍。同种作物根系活力的平均值在不同文献之间差异较大，如小麦6 699倍，苜蓿93倍，水稻11倍。这种差异是植物种和试验处理所无法达到的。因此，不适合的分析方法会导致分析结果的严重失真，误导理论研究和生产实践。

2.2 TPF溶液吸收曲线

为了确保后续试验中比色的可靠性，对TPF乙酸乙酯溶液比色的最适波长进行检测。起始波长700 nm，终止波长380 nm，扫描速度1 200 nm·min-1。结果(图1)显示，在483、484、485和486 nm处有单一吸收峰，吸光值分别为1.115、1.114、1.114和1.113。因此，选择485 nm作为检测波长是合理的。

2.3 保险粉用量与TPF溶液吸光值的关系

本试验是在5 mL 5 mg·mL-1TTC溶液中加入保险粉，生成TPF后再溶于10 mL乙酸乙酯，萃取后比色。理论上保险粉还原TTC过程中，与TTC的摩尔比为1∶1，因此5 mL 5 mg·mL-1TTC溶液中含有25 mg TTC与保险粉反应时，需要保险粉为13 mg。但试验结果(图2)显示，保险粉的用量在150 mg 以下时，保险粉用量与吸光值呈线性相关(R2=0.996 2，n=6,P<0.000 1)，超过150 mg后，吸光值不再增加。因此，保险粉的最低量应为150 mg (约为理论值的11倍)。部分实验指导[15]中，标准曲线制作时，先加入质量分数为0.04%、0.03%、0.02%、0.01%、和0.005%的TTC溶液5 mL，然后各加约2 mg保险粉，并且要求各试管中保险粉用量一致。这一操作是不合理的，因为TTC含量不同，所以保险粉用量可以不同。对应于5 mL 0.04% TTC溶液需要保险粉1.04 mg。原指导书中的用量是超过理论需要量，但实际操作中还达不到需要量(约11 mg)，仍然会导致结果高估。文献分析部分可证明这一点。

表1 基于文献计量的TTC法测定的常见作物及林、草的根系活力Table 1 The roots viability of common crop, tree and grass species tested use of 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride(TTC) based on bibliometric method mg·g-1·h-1

注：原文数据为多个生育期的，选择均值最高的生育期数据。

Note:The original paper data is of mutiple growth stages, highest mean value of growth stage is selected.

图2 保险粉用量对TPF 乙酸乙酯溶液吸光值的影响(5 mL 5 mg·mL-1 TTC，10 mL乙酸乙酯)Fig.2 The effect of Na2S2O4 on ethyl acetate solution with TPF(5 mL TTC 5 mg·mL-1, dissolved in 10 mL ethyl acetate)

3 结论及建议方案

现有的植物生理学实验指导中关于TTC还原法测定根系活力的方法不妥，无论是保险粉2 mg还是“少许”均难以操作。建议标准曲线制作时，在5 mL 5 mg·mL-1TTC溶液中加入0.150～0.200 g保险粉，生成TPF后加乙酸乙酯10 mL，充分振荡后避光静置4 h后制成母液。然后吸取4 mL TPF乙酸乙酯溶液定容至10 mL，得到对应于1 mg·mL-1TTC的TPF溶液，最后分别吸取0.25、0.5、1.0、1.5和2.0 mL 置于10 mL 容量瓶中，用乙酸乙酯定容至10 mL，获得分别对应于0.025、0.05、0.10、0.15和0.20 mg TTC的TPF溶液，485 nm下比色，以对应的TTC质量为因变量，吸光值为自变量建立标准曲线回归方程。