前列腺癌早期诊断相关外周血循环游离核酸的研究进展

王茹月 叶雨

广西医科大学第二附属医院急诊科（南宁530021）

前列腺癌（prostate cancer，PCa）在世界范围内的发病率已连续多年居男性恶性肿瘤发病率首位，病死率居前三位［1］。中国PCa 发病率虽低于欧美国家，但随着人口老龄化和饮食结构的改变，近年来也呈逐年上升趋势［2］。早期发现和确诊对于恶性肿瘤的防治至关重要，而由于传统的PCa 临床诊断指标血清PSA 特异性较低，在良性前列腺疾病中其表达水平亦可出现异常升高，寻找更加准确的生物标志物并与PSA 结合应用是众多学者追寻的方向。

分子诊断技术通过对机体内源性或外源性生物分子的检测辅助临床诊断、监测和治疗，是近年来的研究热点。其中循环游离核酸（circulating cell⁃free nucleic acid，cf⁃NA）检测是针对血循环中游离于细胞外的核酸分子片段，检测其表达量或突变。cfNA 种类和数量丰富，并且取样相对无创、成本低，具有优越的开发应用潜能。目前的研究表明，血循环DNA、长链非编码RNA（long non⁃coding RNA，lncRNA）和短链非编码RNA 中的微小RNA（microR⁃NA，miRNA）以及一些信使RNA（messenger RNA，mRNA）在PCa 诊断中准确度较高，具有很好的应用前景。本文对这些外周血循环游离核酸的研究进展进行了概述。

1 外周血DNA

循环游离DNA（circulating cell⁃free DNA，cfDNA）是细胞凋亡或者其他形式的细胞死亡后释放到血浆中的DNA片段，可以通过分光光度法、荧光染色法、PCR、DNA 测序、分支链DNA 信号放大技术（branched DNA，bDNA）等先进技术手段，从表达水平、完整性、甲基化和突变多个方面评估PCa 外周血cfDNA 的特性。

1.1 DNA 定量测定 由于恶性肿瘤增殖迅速，细胞凋亡坏死后会释放大量循环肿瘤DNA（circulating tumour DNA，ctDNA）并被核酸酶降解，PCa 患者通常比良性前列腺增生（benign prostatic hyperplasia，BPH）患者和健康对照组具有更高水平的血浆cfDNA 浓度和更低的cfDNA 完整性［3］。在健康状态和一些非肿瘤性疾病（如炎症）时，机体内也会存在低水平cfDNA，会干扰测定，且肿瘤发生初期cfDNA 浓度增加可能并不明显，导致DNA 定量检测作为PCa 早期诊断方法准确度不高。但是有研究表明［4］，血浆cfDNA 水平与PCa 转移及肿瘤分期显著相关，或许可以用于监测PCa的病情进展及术后复发情况。

1.2 DNA 甲基化 DNA 甲基化是指在甲基转移酶的催化下，甲基基团以共价结合方式结合到基因启动子cpG 岛的特定区域，从而调节基因的表达，在PCa 发生发展中具有重要作用。谷胱甘肽硫转移酶P1 基因（GSTP1）位于染色体11q13，它的启动子甲基化是PCa 最常见的DNA 改变。研究表明，检测血浆谷胱甘肽硫转移酶P1 基因（GSTP1）启动子甲基化用于诊断PCa 的灵敏度和特异性都很高（分别为95%和87%），预测准确率达到93%［5］。REIS 等［6］利用血清PSA、cfDNA 浓度和血清GADD45a 基因甲基化联合诊断PCa，具有94.1%的灵敏度和87.5%的特异性，AUC 达到0.937。HALDRUP 等［7］成功检测到了血清中高度PCa 特异性的4 种甲基化ctDNA（ST6GALNAC3、ZNF660、HAPLN3和CCDC181）并开发出了一套ctDNA 预测模型，检测PCa具有100%的特异性和67%的灵敏度。此外，许多具有PCa诊断潜能的组织特异性DNA 遗传学改变，均可能在血循环中被检测到，如APC、RASSF1A、RAR⁃b、PCDH10、HIC1等基因的甲基化，尚有待进一步研究。作为一种重要的表观遗传学标志，血循环cfDNA 甲基化出现时间早于经典遗传和生理生化改变［8］，并与癌症化疗反应和总生存期（overall survival，OS）相关［9］，开发应用前景良好，是一种优越的PCa 早期诊断标志物。

1.3 DNA 遗传学改变 DNA 遗传学改变是基因序列的改变，包括基因突变、基因杂合丢失（loss of heterozygosity，LOH）和 微卫星不 稳定性（microsatellite instability，MSI）等。基因突变发生在碱基对水平，癌基因的激活与抑癌基因的失活与肿瘤发生密切相关。癌症发生是多个基因突变共同作用的结果，因此多基因位点联合检测具有较大的价值。如SCHÜTZ 等［10］开发出一组血循环DNA 突变组合，用于诊断PCa 的AUC 高达0.92。此外，研究人员最近进行的人类全基因组序列分析发现了多个遗传性PCa 发病风险相关突变位点，如AR、SPOP、ETS、P53 和PTEN 等基因的畸变，它们在血液中的改变或许同样具有诊断意义。短串联重复序列（short tandem repeat，STR）又称微卫星，广泛存在于人类基因组。重复单元的插入或缺失会导致肿瘤细胞中STR 长度改变，是PCa 发生的重要机制之一。基因杂合丢失是指两个等位基因中的一个发生的序列缺失，常发生在肿瘤细胞的抑癌基因位点。SEYEDOLMO⁃HADESSIN 等［11］发现，血浆短串联重复序列发生的杂合丢失可以帮助鉴别PCa，在他们的研究中有71.05%的PCa 患者具有至少3 种LOH 标记。

由上述研究可知，cfDNA 用于前列腺癌诊断的敏感性和特异性都很高。最近WYATT 等［12］的研究表明，对转移性去势抵抗性前列腺癌（metastatic castration resistant pros⁃tate cancer，mCRPC）患者进行ctDNA 检测足以识别匹配的组织活检中存在的所有DNA 改变，因此是一种很有前景的无创性替代诊断方法。但由于外周血cfNA 是来自于肿瘤细胞片段DNA 释放，丰度相对较低，半衰期短，对采样时间、样品保存要求高，需要更加精准的检测手段。最近，数字PCR 已成为检测cfDNA 点突变的敏感工具，一些新方法与检测系统不断出现（如结合数字PCR 与流式技术的BEAMing 系统）。相信随着技术的进步，血循环cfDNA 将给PCa 的诊断带来突破性进展。

2 外周血lncRNA

LncRNA 是长度＞200 nt（核苷酸）的非编码RNA，它并不编码蛋白质，但与癌症的发生发展密切相关。外周血lncRNA 由活细胞或循环肿瘤细胞分泌，以微泡、外泌体或与蛋白分子结合形式稳定存在于血清、血浆或血细胞，可以通过实时荧光定量PCR（qRT⁃PCR）、基因芯片、转录组测序（RNA⁃Seq）和RNA 荧光原位杂交（RNA⁃FISH）等手段进行定性定量分析。血lncRNA 用于PCa 诊断的相关研究较少，目前发现较有前景的是前列腺癌抗原3（prostate can⁃cer antigen 3，PCA3）和MD⁃miniRNA。

2.1 PCA3 PCA3 位于染色体9q21⁃22，也称DD3，是当前最热门的PCa 标记物之一。PCA3 在PCa 中呈特异性高表达，在正常前列腺、良性前列腺增生组织中不表达或低表达。在尿液中检测PCA3 协助PCa 诊断的“PROGENSA PCA3 测试”已于2012年经美国食品药品监督管理局（FDA）批准上市。近年来研究表明，血液PCA3 作为PCa生物标志物也表现出良好的应用价值，诊断特异性很高（94%），但敏感性欠佳（32%）［13］。此外，血lncRNA PCA3的水平在Gleason 评分≥8 的高级别PCa 患者中明显高于Gleason 评分≤7 的患者，可以帮助评估肿瘤的恶性程度和侵袭性［14］。

2.2 MALAT1 源MD⁃miniRNA MD⁃miniRNA 是lncRNA肺腺癌转移相关转录子1（metastasis⁃associated lung adeno⁃carcinoma transcript 1，MALAT1）含量最多的血浆片段形式，也具有很强的特异性。在组织和尿液中检测这种ln⁃cRNA 作为PCa 生物标志物的价值已得到越来越多的肯定。REN 等［15］和XUE 等［16］的研究表明，将外周血MD⁃miniRNA 应用于PCa 诊断虽然敏感性稍低（在2 个研究中分别为58.6%和76%），但特异性有优势（在2 个研究中分别为84.8%和90%），受试者曲线下面积大于血清PSA（0.836vs.0.770），特别是当血清PSA 水平处于4～10 ng/mL（PSA 诊断的“灰色区域”）时这种优势更显著。因此可以推测，血浆MALAT1 源MD⁃miniRNA 可能较适于当PSA 处于灰色区域时用于增加PCa 的诊断准确度。这两个实验的研究数据都来源于国内人群，因此对中国人而言血MD⁃miniRNA 可能是一种很有前景的生物标志物，与特异性稍差的PSA 联合是值得期待的应用方向，可以减少良性病变的误诊，增强PSA 的诊断效能。

综合以上研究，外周血lncRNA 单独诊断PCa 的特异性强，但敏感性低，因此较适于与灵敏度强的其他标志物联合使用。考虑到血检不需要进行组织穿刺或排尿前前列腺按摩，患者耐受程度更好，且受取样点、操作方式等因素影响小，包含lncRNA 的血液标志物联合检测可能是优于PSA、lncRNA 组织活检和尿检的PCa 早期诊断指标。因此，在未来的研究中继续寻找PCa 特异性lncRNA 血循环片段作为诊断标志物具有广阔的探索前景。

3 外周血miRNA

MiRNAs 为20～24 nt 长度的小分子片段，与转录后基因表达与调控相关。MiRNAs 在外周血中以脂质或脂蛋白复合物如凋亡小体、微泡或外泌体等形式存在［17］，具有抗内源性核糖核酸酶活性，稳定性和丰度都很高，可以通过Northern blot、微点阵分析和qRT⁃PCR 等方法进行检测。自从2008年有学者第一次发现血miR⁃141 水平可以区分PCa患者和健康个体（灵敏度60%，特异性100%），越来越多的PCa 特异性血循环miRNAs 被发现。

3.1 单一miRNA 作为PCa 诊断生物标志物

3.3.1 MiR⁃375 研究表明，血清miR⁃375 鉴别PCa 的效力优于PSA（两者的AUC 分别为0.720 和0.603），联合尿激酶型纤溶酶原激活物受体蛋白诊断准确度更高（AUC 值由0.720 增加到0.755）［18⁃19］。另一项研究表明，血浆来源的miR⁃375 同样具有良好的PCa 诊断效能，优于PSA（AUC 分别为0.809 和0.710）［20］。

3.3.2 MiR⁃21 YAMAN 等［21］测量了51 例PCa 患者和20名健康对照的血液miR⁃21 水平，发现病例组和对照组间存在的差异具有统计学意义（P＜0.001），miR⁃21 具有很好的PCa 诊断效能，AUC＝0.88。KOTB 等［22］对20 例PCa 疑似病例进行的前瞻性研究发现，血清miR⁃21 具有比PSA ≥10 ng/mL 更高的预测诊断潜能（敏感性90%，特异性90%）。然而，在YAMAN 等［21］发表的研究成果中，未报道miR⁃21 与血清PSA 进行诊断效能比较的数据；而KOTB等［22］的实验样本量太小，因此两个实验的结果尚不足以说明外周血miR⁃21 单独应用具有超越血清总PSA 的PCa 诊断价值，有待进一步研究验证。

3.3.3 MiR⁃628⁃5p SRIVASTAVA 等［23］进行血清miRNAs表达谱分析发现PCa 特异性最强的miRNA 是miR⁃628⁃5p（P＜0.000 1），在临床研究中诊断PCa 的AUC 高达0.94，或许具有良好的应用价值。目前miR⁃628⁃5p 对于中国人种的PCa 诊断价值尚未见文献报道，可以考虑在中国人群进行大样本验证。

3.3.4 MiR⁃410⁃5p WANG 等［24］首次发现PCa 患者外周血树突状细胞中miR⁃410⁃5p 的表达异常增高（比非癌患者高达7.5 倍），用于早期诊断具有很好的效能（AUC＝0.809 7），与PSA 结合使用效能更高（AUC＝0.827 4），并可用于评估肿瘤的恶性程度和预后。

除了上述几种miRNAs，最近研究发现有PCa 早期诊断价值的指标还包括miR⁃320 家族（miR⁃320 a/⁃b/⁃c），3 种miRNA 区分PCa 和健康对照组的AUC 分别为0.894、0.714和0.840［25］。外周血miRNAs 应用于PCa 早期诊断敏感度、特异性都很好，且有研究表明基于血液的miRNA 的检测具有比非血来源miRNA 检测更高的敏感性［26］，因此被认为是最有研究价值的生物标志物种类之一。许多在恶性肿瘤中呈现普遍异常表达的miRNAs，均被报道具有PCa诊断价值。这些发现若经大样本人群验证，将有望应用于临床工作中。除了很好的早期诊断潜能，外周血miRNAs还与肿瘤分期、根治性前列腺切除术后生化复发等临床病理特征相关［18，25］，可以帮助评估患者的病情和预后。

3.2 miRNAs 联合诊断模型 当前越来越多的学者致力于建立生物标志物联合诊断模型，以进一步增加PCa 的预测准确度。文献已报道了多个得到临床验证的模型，如miR⁃141、miR⁃21 和miR⁃375 联合模型，miR⁃141、miR⁃145、miR⁃155 和let⁃7a 联合模型，miR⁃16⁃5p 和%fPSA（血清游离PSA 和总PSA 的比值）联合模型，miR⁃4289、miR⁃326、miR⁃152⁃3p 和miR⁃98⁃5p 联合模型［19，27⁃29］，以及DANIEL 等［30］实验中检测到的7 种在PCa 患者血液中特异性表达的mi⁃croRNAs 联合模型（由上调的miR⁃127⁃3p、miR⁃204⁃5p、miR⁃329⁃3p、miR⁃487b⁃3p 和下调的miR⁃32⁃5p、miR⁃20a⁃5p、miR⁃454⁃3p 组成），均具有优于单一指标的PCa 诊断效能。由于不同种族间生物标志物的诊断价值可能存在差异，参考上述研究结果进行大样本人群验证以开发出更多适于中国人群的血miRNAs 联合诊断模型，是很有意义的研究方向。

4 外周血mRNA

除了外周血cfDNA、lncRNA 和miRNA，部分血循环蛋白mRNA 和基于肿瘤的血小板（tumor⁃educated platelets，TEPs）mRNA 也具有很好的PCa 诊断准确度。

4.1 蛋白mRNA 随着蛋白质组学以及高通量测序技术的发展，许多循环蛋白分子被检测到发生了PCa 特异性表达改变。mRNA 携带蛋白质的全部遗传信息，可以反映器官或组织的异常或病理状态。早在2012年就有学者采用平均差异表达方法检测了全血RNA 生物标志物，发现环指蛋白RNF19A 的mRNA 在PCa 患者血液中表达量明显增高（超出健康对照组2 倍水平），诊断PCa 的AUC＝0.727（作为参考的PSA 的AUC 值范围0.640～0.678）［31］。此外，端粒位于染色体末端，与细胞分裂有关，肿瘤细胞中常常存在端粒酶活性的异常激活。MARCH⁃VILLALBA 等［32］的实验表明，人端粒酶逆转录酶（hTERT）mRNA 可能是一种有用的PCa 诊断标志物，比血清PSA 显示出更高的敏感性（85%vs.83%）、特异性（90%vs.47%）、阳性预测值（83%vs.56%）和阴性预测值（92%vs.77%）。

由于血循环mRNA 水平受到多种因子调节，如蛋白表达量、核酸酶、上游的DNA 和非编码RNA 等，与蛋白表达量不一定成正比，仅仅检测蛋白mRNA 是不够的。血循环蛋白分子研究常将蛋白组学内容（如蛋白表达量的变化、翻译后修饰，细胞定位改变）与转录组学内容（检测血浆蛋白mRNA）结合，寻找PCa 诊断特异性蛋白。如在多种癌症中呈现异常表达的高尔基体磷蛋白3（GOLPH3）和肝配蛋白⁃A2（Ephrin⁃A2），最近都被证明是有前景的PCa 血循环诊断标志物［33⁃34］，此外，GOLPH3 水平还被证明与格里森评分、淋巴结转移和临床分期相关［34］。

4.2 TEPs mRNA 近年来研究人员发现，血小板能够释放一种抑制免疫T 细胞活性的分子—TGF⁃β，导致肿瘤细胞的“免疫逃逸”［35］，与癌症的发生和迁移关系密切。BEST M G 提出对TEPs 进行mRNA 测序可用于诊断癌症，TEPs 区分癌症患者与健康人的准确率达96%［36⁃37］。但这种测序诊断方法尚未在PCa 中得到验证，因此可以考虑纳入未来的研究方向。

有研究表明，肿瘤细胞中mRNA 的突变区拷贝数要远远多于DNA 的突变区拷贝数［38］，诊断特异性比DNA 更强，但由于外周血mRNA 种类繁杂，灵敏度和丰度较差，结构相对不稳定，限制了其单独应用价值，但或许可以应用于分子联合诊断，有待继续研究验证。

5 总结与展望

随着分子诊断技术的不断进步，人们有望开发出灵敏度和特异性更好的PCa 外周血cfNA 标记物，与传统的血清PSA 和影像学手段结合使用以减少临床误诊和漏诊。血循环含有丰富的生物标志物种类可供重复取样及联合检测、病情动态监测，因此血液cfNA 在PCa 诊断方面具有广阔的研究前景。但是如何将其应用于临床尚面临诸多挑战，如对cfNA 样品采集储存、分析研究手段、实验设备条件等制定统一标准，以实现检测标准化；许多研究存在样本量太少的问题，需要进一步进行大规模、多中心的临床前瞻性研究，构建更有参考价值的大数据集合。此外，开发出更加快速、经济、精准可靠的检测技术，增加医生和患者的接受度，也是需要解决的问题。