非洲猪瘟疫苗研究新进展

谢伟 唐眉 赵国芝 王钢

非洲猪瘟疫苗研究新进展

谢伟①唐眉①赵国芝①王钢②*

（①四川省乐山市动物疫病预防控制中心 614000 ②乐山师范学院 四川 乐山）

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒引起猪的一种急性、热性、出血性和高度接触性传染病，死亡率高达100%。给许多国家养猪业造成了严重打击。该病由于基因组庞大且免疫逃逸机制复杂，至今尚无有效的预防疫苗和治疗药物。本文针对非洲猪瘟疫苗的相关研究进展进行了综述，以期为该病疫苗的研发提供参考。

非洲猪瘟(African swine fever, ASF)是引起猪的一种急性、热性和高度接触性传染病，临床症状以高热、内脏严重出血和高死亡率为特征。世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。1921年，该病首次在肯尼亚报道[1]，并陆续在非洲大部分国家发生。20世纪60年代传入欧洲，70年代传入南美洲；2007年传入格鲁吉亚和俄罗斯联邦和东欧地区，且呈现蔓延趋势[2]；2017年3月在距离中国边境仅1000公里的俄罗斯伊尔库茨克暴发[3]。2018年8月该病在我国辽宁沈阳首次确诊，不到一年时间全国多个省份均有发生，给我国生猪产业造成严重影响。

ASF病原为非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)，属于非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属，是目前唯一已知的虫媒DNA病毒，具有双层囊膜的二十面体结构[4]。ASFV基因组全长介于170-190kb之间，含有151-167个开放阅读框(ORFs)，可编码150-200个蛋白质，其中结构蛋白50多种。根据该病毒主要衣壳蛋白P72的编码基因，可将其分为22个基因型，由于其表现出明显的遗传多样性，加之抗感染机制非常复杂，截至目前对于ASF尚无有效的药物和其他治疗手段。因此，加快ASF疫苗的研发和制定有效的防控措施显得迫在眉睫。目前，我国正在加大ASF疫苗研究力度。

1 灭活疫苗

通过物理或化学手段将病原灭活，使其丧失感染能力，但保留免疫原性的方法制备的疫苗称为灭活疫苗。自ASF发现之后，研究人员就开始研制灭活疫苗。然而至今为止，采用多种方法制备的ASF灭活疫苗，虽然部分灭活疫苗可产生较高效价的抗体，但在临床上均不能提供有效的免疫保护[5, 6]，即使是使用PolygenTM或Emulsigen等最先进佐剂也不能产生有效的保护[7]，这可能是由于ASFV免疫机制非常复杂，细胞内病毒颗粒和细胞外病毒颗粒表面蛋白差异较大，灭活疫苗不能刺激机体产生高水平中和抗体[8]。结果提示，按照现有的灭活疫苗研究技术，很难研发出有效的ASFV灭活疫苗。

2 弱毒疫苗

弱毒疫苗是指用人工致弱或自然筛选等方法制备的弱毒株经培养后制备而成，它一种病原致病力减弱但仍具有活力的完整病原疫苗。根据弱毒疫苗毒株来源不同，可将ASFV弱毒疫苗分为天然致弱疫苗和人工致弱疫苗，其中人工致弱疫苗又分为传代致弱疫苗和重组致弱疫苗。

2.1 天然弱毒疫苗 目前，ASFV天然弱毒疫苗毒株有NH/P68、OURT88/3和Lv17/WB/Rie1三种，其中NH/P68和OURT88/3属于基因I型，Lv 17/WB/Rie1属于基因II型[9]。Leitao等[10]研究表明，免疫ASFV NH/P68的家猪对高毒性ASFV/l60毒株的攻击具有抵抗力，但是可导致25%~47%的免疫猪出现慢性感染。免疫ASFV OURT88/3后的家猪，可对OURT88/1、Benin97/1和genotype X毒株产生免疫保护，但会出现发热、关节肿胀等诸多临床症状[11, 12]。Gallardo等[9]将从野猪分离的Lv17/WB/Rie1株感染猪后只有非特异性临床症状或者没有临床症状，且可产生保护作用。Barasona等[13]研究表明，Lv17/Wb/Rie1菌株进行口服免疫，可产生针对毒性ASF病毒分离物攻毒的92%的保护性，且具有较好的安全性，标志着在野猪中控制非洲猪瘟取得了巨大进展。 ASFV天然弱毒疫苗虽然可以对同源和部分异源毒株产生保护，但免疫副反应和散毒等生物安全风险是限制其应用的关键因素。

2.2 传代致弱疫苗 ASFV可在Vero、COS-1等细胞内传代培养，使其致病力不断下降。有学者证实通过传代致弱的ASFV弱毒疫苗可以抵御强毒株的攻击[14]，但在随后的田间试验却造成了严重后果，许多免疫猪出现了肺炎、流产、死亡等副反应，且存活的生猪大部分携带病毒[8, 15]。Krug等[16]将ASFV-G在Vero细胞中传至110代时，其毒力完成丧失，将其免疫猪后并不能抵御ASFV-G的攻击。Lacasta等[17]将E75强毒在CV1细胞上传代致弱的毒株免疫猪后发现，传代致弱毒株疫苗能抵御同源毒株E751的攻击，但不能抵御异源毒株BA71的攻击。研究表明，ASFV传代致弱疫苗安全性和异源保护力较差，这也是需研究突破的重点。

2.3 重组致弱疫苗 随着分子生物学的发展和ASFV基因功能的不断探索，对ASFV的某些毒力基因(如TK、UK、NL、CD2v等)、多基因家族(如MGF360/505)、免疫逃逸相关基因(如A238L、DP148R、MGF等)等基因敲除后可降低病毒毒力或增加宿主的免疫应答[18]。Abrams等[19]将DP71L和DP96R基因敲除构建的OUR T88/3∆DP2重组疫苗免疫猪后，对强毒株OUR T88/1攻击有66%的保护，对亲本毒株OUR T88/3攻击则100%保护，且免疫动物没有出现严重副反应。Reis等[20]将构建的MGF530和MGF360缺陷毒株Benin∆MGF免疫猪后发现，能够100%抵御Benin 97/1的攻击，而sanchez-Cordon等[21]研究结果最高保护率为83%，提示免疫剂量、免疫方式等影响免疫保护效果。Monteagudo等[22]研究表明，CD2v基因缺失构建的BA71∆ CD2毒株具有交叉保护作用，能够对BA71提供100%保护，而且也可抵御基因II型Georgia2007/1株的攻。最近，西班牙学者以野毒株NH/P68为骨架，构建了A238L、A224L、EP153R和A276R等4种蛋白缺失株；攻毒试验表明，缺失株和NH/P68疫苗均能够抵御同源病毒L60的攻击，但对于AEM07异源病毒攻击，NH/P68疫苗能够完全抵御而缺失株仅有半数免疫了A224L能够抵御[23]。总之，研究表明ASF重组致弱疫苗可提供完全的同源保护、完全或部分的交叉保护，在未来疫苗开发中前景较大，但目前仍存在残余毒力、病毒血症等问题。

3 核酸疫苗

核酸疫苗又称DNA疫苗，是将含有编码主要抗原的基因克隆入真核表达载体并导入动物体内，通过宿主细胞表达抗原蛋白，诱导宿主细胞产生对该抗原蛋白的免疫应答。2011年，Argilaguent等[24]将ASFV的P30和P54基因与猪白细胞抗原II抗体单链可变区融合构建的质粒，虽然可使部分生猪获得一定的免疫保护效果，但不能抵御强毒株的攻击。2012年，Argilaguent等[25]研究发现，ASFV血凝素蛋白基因与P30、P54基因融合构建的质粒，能成倍地提高实验猪免疫后的体液反应和细胞反应，但不能抵御ASFV-E75的攻击；但将泛素基因与上述DNA疫苗融合后，可增强诱导CTL应答，并能够使部分实验猪获得免疫保护，提示细胞免疫在ASF预防中至关重要。Lacasta等[26]构建的一个包含4000多个质粒表达文库对猪免疫后，可对E75菌株产生60%的保护率，且存活生猪无排毒现象，这能有效解决目前ASF疫苗生物安全问题。目前，虽然关于ASF核酸疫苗研究的还比较少，但随着ASFV保护性抗原和表达载体的不断研究，ASF核酸疫苗在将来一定有重大突破。

4 亚单位疫苗

ASF亚单位疫苗是指将ASFV保护性抗原基因在原核或真核细胞中表达，并将产生的蛋白质或多肽通过适合的抗原传递系统免疫动物而诱导产生中和抗体。P30、P54和P72是ASFV感染过程中引起体液免疫应答的3个重要抗原蛋白，其中P54和P72产生抗体可阻止病毒吸附，P30产生抗体可阻止病毒内吞[27]。重组表达的P30或P54蛋白以诱导中和抗体的产生，但不能提供有效的免疫保护[28]，同时免疫P30和P54两种蛋白时可提供部分保护[28, 29]，然而同时免疫P30、P54和P72三种蛋白时却不能提供免疫保护[30]。最新研究结果表明，将载体表达ASFV抗原首免和减毒活疫苗加强免疫结合起来，可以扩大对ASFV对表位的识别Murgia等[31]，这为ASFV不同类型疫苗联用提供了理论依据。

5 病毒活载体疫苗

通过腺病毒、痘病毒等载体表达ASFV保护性抗原基因，免疫猪只后可产生更好的特异性抗体和CTL反应。Lokhandwala等[32, 33]以腺病毒为载体表达的ASFV抗原基因，采用“鸡尾酒”式免疫后获得了较好的抗原特异性CTL应答。Madrid等[34]以痘病毒为载体表达的ASFV抗原基因，采用加强免疫策后可诱导ASFV特异性抗体和T细胞应答。Murgia等[31]以α病毒为载体，构建的ASFV p30(rp-30)、p54(rp-54)或pha-72(rp-sha-p72)抗原载体，其中rp-30在Vero细胞中表达最高并且具有较好的免疫原性。目前，ASF病毒活载体疫苗研究仍属于起步阶段，其安全性、有效性仍需要通过实验进一步研究证实。

6 展望

随着经济全球化的发展，人员和贸易来往频繁加剧，2018年以来中国、越南等国家相继发生ASF疫情，疫情趋势呈现全球流行，给我国养猪业带来重大威胁[35]。2019年1月，中国启动非洲猪瘟病毒基因缺失活疫苗研发项目。目前虽然研制的ASFV疫苗还存在保护力不强、病毒血症、残余毒力等方方面面的问题，但相信不久将来，随着世界各国对非洲猪瘟疫苗研发的日益重视，有效的、安全的ASFV疫苗会被研发出来。

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（2019–05–17）

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