光动力对白色念珠菌生物膜的作用研究进展

杨倩 黄力毅

广西医科大学第一附属医院感染科（南宁530000）

近年来，随着抗菌药物的广泛应用及免疫缺陷病患者数量增多，真菌感染是较常见的临床问题，念珠菌是最常见的真菌病原体之一，同时也是医院获得性感染的主要病原菌，而白色念珠菌感染在相关念珠菌属中的发病率最高［1-2］，其常寄生在人体的口腔、皮肤、肠道黏膜及阴道等部位。当宿主免疫力低下或寄居处微环境发生改变，则易导致浅表性或全身系统性感染。现有的抗真菌药物浓度对浮游态白色念珠菌有效，但对已形成生物膜中的白色念珠菌细胞无效，虽然更高的浓度可以有效地对抗生物膜，但这些高剂量往往会对宿主造成严重的副作用（肝或肾毒性），耐药率也越来越高，难以彻底根治［3-4］。白色念珠菌耐药性与生物膜形成有关［5］，研究表明微生物生物膜占人类所有细菌和真菌感染的80%［6］，因此开发新的抗生物膜方法显得尤为迫切，光动力疗法（photodynamic therapy，PDT）作为一种可替代传统抗菌疗法的新型非侵入性疗法，可使生物膜实质性的减少，甚至彻底的根除［7］。相关研究［8-11］表明PDT 可以抑制白色念珠菌生物膜形成、破坏生物膜结构、杀灭生物膜内菌体以及影响生物膜相关基因的表达，从而有效灭活耐药性白色念珠菌。本文主要从以下5 个方面阐述PDT 对白色念珠菌生物膜作用的研究进展。

1 PDT 的概念及作用机制

PDT 是光敏剂（photosensitizer，PS）在光源照射下发生激化反应引起一系列级联反应产生大量活性氧物质导致靶细胞发生不可逆损伤的治疗方法。其作用机制涉及吸收光子激发PS 到其短寿命的单重态，然后经历电子跃迁到更长寿命的三重态，较长的寿命允许三重态PS 与两种不同的光化学（Ⅰ型和Ⅱ型）途径之一的环境（基态）氧反应。在Ⅰ型光化学反应中，PS 通过电子转移方式生成羟自由基、超氧阴离子、过氧化氢等；Ⅱ型光化学反应是PS通过能量碰撞转移方式产生单线态氧。根据激发态PS 所处的位置，所产生具有细胞毒性的活性氧物质，迅速诱导损伤周围环境中微生物的细胞壁、脂膜、蛋白质等，最终非特异性地杀灭微生物［12］。

2 白色念珠菌生物膜的形成过程及影响其形成的因素

白色念珠菌生物膜形成过程大致分为4 个阶段：早期（0～11 h）白色念珠菌细胞以芽生孢子的形式附着于物体表面并继续繁殖；中期（12～30 h）细胞分泌胞外聚合物，黏结单个真菌细胞而形成真菌团块，进而形成分散的微菌落，并逐渐融合形成生物膜的基底层；成熟期（31～72 h）细胞外基质的不断产生和释放，覆盖在真菌微菌落表面直至将细胞完全包裹，同时随菌丝或假菌丝的形成，结构逐渐复杂，发育为成熟的生物膜；72 h 后生物膜结构发生解离，酵母相的细胞脱落下来，继续形成新的生物膜。胞外聚合物、微生物细胞表面和细胞内生物分子是影响生物膜形成的三大因素，其中胞外聚合物通过“聚合物桥接”过程克服微生物细胞与基质之间的静电排斥，从而确保微生物细胞附着或锚定到基质［7］，这一过程对细胞的初始黏附是至关重要的。

3 白色念珠菌生物膜耐药性及耐药机制

白色念珠菌复杂的生物膜形成，使其耐药性增加。研究表明，念珠菌生物膜细胞对抗真菌药物如两性霉素B、氟康唑、伊曲康唑和酮康唑的抗药性比浮游细胞高30 ～2 000 倍［13］。其耐药机制可能与生物膜外基质的屏障作用、生物膜内细胞生长缓慢和营养限制、相关耐药基因表达、细胞膜甾醇代谢异常、药物外排泵的上调以及持留细胞的存在等有关［14-16］。研究证实PDT 的抗菌作用与微生物细胞是否存在抗菌药物抗药性无关［17］。

4 PDT 对白色念珠菌生物膜的作用

4.1 抑制生物膜形成酵母和菌丝型细胞的发育对生物膜的形成至关重要。PINTO 等［8］体外研究证实甲苯胺蓝-O（toluidine blue o，TBO）介导的PDT 能够抑制生物膜的整个形成阶段。经过不同浓度（0.01、0.02、0.05、0.1 mg/mL）的TBO 介导的PDT 处理白色念珠菌ATCC10231，通过测定在不同发育阶段（6、12、24、48 h）形成的生物膜的代谢率，证实上述4 种浓度的TBO 均可以不同程度地抑制生物膜形成，并且在生物膜的不同发育阶段都观察到这种抑制效应，其中0.1 mg/mL 的TBO 介导的PDT 可以抑制约50%生物膜形成。该研究利用光学显微镜观察比较PDT（0.1 mg/mL TBO）治疗前后生物膜的变化，治疗前，12 h 的生物膜形成过程中，酵母和丝状体的细胞数量减少，而48 h 的生物膜形成呈现出更多的细胞，包括丝状体。治疗后，观察到生物膜结构中细胞数量的减少，在12 和48 h 的生物膜形成中，丝状体完全没有细胞，而对照组中当细胞被单独照射或单独使用TBO 时，形成的生物膜的形态没有改变。研究结果表明，TBO 介导的PDT 可以通过减少从酵母菌到丝状体的过渡过程，从而有效地减少生物膜形成，这可能是PDT 抑制生物膜形成的机制之一。QUISHIDA［18］研究也得到了相似的结论，发现白色念珠菌ATCC90028 不同发育阶段（24、48 h）生物膜对不同浓度（80、100、120 μmol/L）的姜黄素介导的PDT 都是敏感的，且24 h 生物膜比48 h 生物膜对PDT 更敏感。CARVALHO 等［9］研究证实二氢卟酚e6介导的PDT 可降低白色念珠菌ATCC10231 形成生物膜的能力，当二氢卟酚e6 浓度为7 μmol/L，可抑制50%生物膜形成；当二氢卟酚e6 浓度为20 μmol/L，生物膜形成率降低了90%以上。同时，通过光学显微镜观察到酵母细胞和菌丝形成都大大减少，在生物膜结构中完全没有丝状形式，表明PDT 对生物膜形成的抑制与减少芽殖酵母形式到丝状形式的转变有关，这是定植和毒力的重要阶段。DAVIES 等［19］体外实验证实PDT 能够减少白色念珠菌生物膜形成，在室温37 ℃条件下，经过52.2 μmol/L 的咪康唑孵化2 h，紧接着7.3 μmol/L 的四甲苯磺酸卟啉孵育30 min，能量密度为58.5 J/cm2的可见光照射，用XTT 实验测定发现ATCC 菌株（白色念珠菌MYA-2732、白色念珠菌MYA-274）及临床分离株（白色念珠菌6122/06）生物膜形成分别减少60%、46%、73%，其抑制效果均显著高于单独使用咪康唑组或四甲苯磺酸卟啉介导的PDT 组。这种联合疗法为将来用于假牙和口腔表面念珠菌生物膜的治疗提供依据。KHAN 等［20］探索了新型纳米金颗粒（gold nanoparticles，GNP）增强亚甲蓝（methylene blue，MB）介导的PDT 对顽固性致病性白色念珠菌生物膜的作用，用MB 介导的PDT 可以抑制81.9%生物膜的形成，实验证明同时结合GNP，可以增加对生物膜的抑制，其抑制率为95.4%。QUISHIDA等［21］研究证实不同浓度（175、200 mg/L）的二氢卟吩e6 衍生物光狄沙嗪介导的PDT 均能减少白色念珠菌ATCC90028 生物膜生物量，并且连续3 次PDT 的应用效果更明显。

4.2 破坏生物膜结构生物膜复杂的空间网状结构使得抗真菌药物无法直接作用于内部的真菌，其机械稳定性取决于微生物分泌的胞外聚合物的组成和数量［22］，同时胞外聚合物作为抵御抗生素和生物杀菌剂扩散的第1 道防线，也限制了PS 的渗透［7］。由于PDT 涉及到活性氧物质的原位生成，生物膜结构上的重要元素很有可能被氧化破坏，从而削弱生物膜的完整性［23］。KHAN 等［20］利用体外实验评估GNP 装载MB 介导的PDT 对白色念珠菌ATCC90028生物膜结构的影响，用扫描电子显微镜观察，与对照组比较，实验组出现生物膜萎缩，菌丝完全破裂，并以不规则形状物质的形式聚集，导致生物膜规则空间三维结构的消失，白色念珠菌生物膜结构被MB 介导的PDT 破坏。CARVALHO 等［9］研究证实20 μmol/L 的二氢卟酚e6 介导的PDT可有效改变白色念珠菌ATCC10231 生物膜结构，用光学显微镜观察，与对照组比较，实验组中酵母细胞和菌丝形成都大大减少，在生物膜结构中完全没有丝状形式。孙红英等［24］利用共焦显微镜检测5-氨基酮戊酸介导的PDT 对白色念珠菌ATCC90028 生物膜活性的抑制作用，计算杀菌率的变化，通过定量分析5-氨基酮戊酸介导的PDT 对生物膜结构的破坏效果，证实其对生物膜结构有一定的破坏作用。这种破坏生物膜结构的现象，在动物模型中也得到证实，SHERWANI 等［11］在雌性BALB/c 小鼠背部及口腔分别建立感染白色念珠菌ATCC90028 的模型，经组织病理学分析，证实单独GNP-MB 组、GNP-TBO 组以及GNP-MB 和GNP-TBO 组介导的PDT 均可以减少小鼠舌背的酵母细胞和菌丝纤维的穿透，并且发现GNP-MB 和GNP-TBO 具有明显的协同作用，从动物模型中可见GNP 能够增强PDT 的抗生物膜能力，其抗生物膜作用在牙周炎和种植体周围炎等牙科感染中有特殊应用［25-26］。迄今为止，在控制牙科生物膜感染的新方法中，PDT 是导致微生物耐药概率最小的一种疗法［27］。

4.3 杀灭生物膜内菌体生物膜本质上主要由菌细胞群体组成，PDT 是一种细胞毒性治疗方法，它能引起细胞凋亡或坏死，研究证实PDT 在体内外均能杀死生物膜内的细胞［22］。SHI 等［10］体外研究发现经5 mmol/L 的ALA 孵育5 h，用波长为635 nm、不同能量密度（50、100、200、300 J/cm2）的红光分别处理白色念珠菌ATCC90028 形成的生物膜，用LIVE/DEAD 真菌生存试剂盒进行快速免疫荧光染色，与对照组相比，白色念珠菌ATCC90028 生物膜中的细胞分别被抑制59.82%、67.95%、71.70%、74.45%。ROSSONI 等［28］体外研究白色念珠菌血清型A 和B 的生物膜对PDT 的敏感性。300 μmol/L 的MB 孵育5 min，波长660 nm，能量密度26.3 J/cm2的激光分别照射白色念珠菌A（ATCC36801）和白色念珠菌B（ATCC36802）形成的生物膜后，用无菌牙签将生物膜细胞刮下壁，在超声匀浆器中对于生物膜进行破坏后进行培养测定，与对照组相比，发现MB 介导的PDT使白色念珠菌A 和B 生物膜细胞分别减少了64%和99%。ERNÁKOVÁ等［29］体外研究证实PDT 抗白色念珠菌生物膜的作用是显著有效的，经1 mmol/L 的MB 孵育1 h ，波长为660 nm、输出功率为190 mW/cm2的红色激光分别处理氟康唑敏感菌株白色念珠菌SC5314 和氟康唑耐药菌株白色念珠菌CY1123 形成的生物膜，能量密度为15、23、57 J/cm2时，敏感菌株和耐药菌株生物膜的生存率分别为24.57%、23.46%、22.29%和40.28%、17.91%、5.89%。结合激光共聚焦显微镜观察证实以活力菌丝为主的白色念珠菌SC5314 生物膜，PDT 的能力受到限制，增加能量密度并没有提高PDT 抗生物膜的效率，而酵母形态为主的白色念珠菌CY1123 生物膜对PDT 更敏感，随着能量密度的提高，PDT 抗生物膜的效率显著增加。在PDT 中，PS 的选择对抗菌疗效至关重要，研究发现微生物细胞比哺乳动物细胞更具有明显的负电荷，阳离子PS 选择性的结合，与微生物细胞的结合相对较快，而哺乳动物细胞对阳离子PS 的吸收较慢［12］。

4.4 影响生物膜相关基因的表达白色念珠菌生物膜的基因表达与浮游细胞不同，其形成过程错综复杂，受多种调控机制的影响。分泌型天冬氨酸蛋白酶（SAP）、磷脂酶B（PLB）、脂肪酶（LIP）、菌丝壁蛋白1（HWP1）、凝集素样序列（ALS）等基因在白色念珠菌生物膜中持续表达。FREIRE 等［30］研究了300 μmol/L 的MB 介导的PDT 处理9个白色念珠菌的临床分离株（分别从9 例艾滋病患者口腔分离）和1 个白色念珠菌参考菌株ATCC18804，分析以上基因的表达情况，结果表明SAP5 基因的表达减少了60%，LIP9 和PLB2 基因的表达减少了50%，但与对照组相比差异无统计学意义，证明以MB 为PS 介导的PDT 对基因的表达仅有轻微的作用。此外，FREIRE 等［31］的另一个研究通过评价300 μmol/L 的MB 介导的PDT 和400 μmol/L 的赤藓红介导的PDT 对3 种白色念珠菌（1 种为标准菌株ATCC18804，另2 种分别从HIV 阳性患者和义齿口腔炎患者的临床样本中分离得出）生物膜的影响，应用实时定量聚合酶链反应检测方法证实以上两种PDT 组合均使白色念珠菌生物膜ALS3、HWP1、BCR1、TEC1、CPH1 和EFG1 基因表达均下调，毒力降低，而对照组中以上分析基因均无明显的变化，同时通过分析这两个PDT 组合抗白色念珠菌生物膜疗效，两者之间差异无统计学意义，但与对照组相比差异有统计学意义。SHERWANI 等［11］转录分析研究表明GNP 介导的PDT 处理白色念珠菌ATCC90028 生物膜后，与对照组相比差异有统计学意义，对两种重要基因ALS3 和HYR1 均有抑制作用。何淼等［32］体外研究标准株ATCC10231 和ATCC90028 形成生物膜的早期、中期和成熟期，分别提取总RNA，应用半定量逆转录-聚合酶链反应检测8 个ALS 基因的表达情况，发现在整个生物膜形成的时期，ALS1、ALS2、ALS3 和ALS5 持续高表达，是主要表达的黏附素基因，而ALS6、ALS7、ALS9，尤其是ALS4 则表达较弱。邓可可等［33］研究也发现ALS3 的表达与白色念珠菌形成生物膜的能力相关。研究结果提示PDT 可能抑制白色念珠菌生物膜ALS 基因家族的其他有关高表达基因。

5 结语和展望

生物膜是导致人类微生物持续感染的主要原因。PDT 在治疗复发和慢性生物膜感染有良好的前景。PDT具有多靶点，不仅能有效杀死微生物细胞本身，而且生成的活性氧物质可以通过攻击大量生物分子削弱和降解基质结构、胞外聚合物。不同于传统抗菌药物的单一行为模式，PDT 既不引起微生物的耐药性，也不受现有耐药状况的影响，其非特异广谱杀菌性质意味着在感染病原体被鉴定以前就可以使用，虽然人类许多感染发生在身体深处，但是现在有可能通过内窥镜仪器、窄直径的间隙插入针、光纤将PS 和光传送到几乎任何解剖部位发挥抗菌作用，从而有效应对抗菌药物耐药性危机。目前相关研究主要集中在体外和动物模型实验，临床实验研究较少。未来新型安全PS 的研发问题、可见光光源最适宜PS 的波段选择以及机体对PDT 治疗过程中产生的过敏反应问题，如果能得到进一步的研发和解决，将会是一个硕果累累的研究方向。随着对生物膜作用机制的进一步研究以及实验条件的优化，PDT 的抗生物膜潜力将具有越来越高的临床应用价值，尤其应用在医疗器械（如植入物和导管）生物膜感染以及艾滋病患者合并口腔念珠菌慢性感染的治疗。