肿瘤干细胞的耐药机制研究进展

王露瑶，吕娟，阮红杰

(南京医科大学附属妇产医院/南京市妇幼保健院，南京210004)

尽管目前的手术和放化疗能够减小肿瘤的体积和延长患者的生命，但肿瘤复发和多药耐药的发生仍是目前肿瘤治疗的两大障碍。肿瘤干细胞(CSCs)理论认为，肿瘤是异质性细胞群体，存在着一小部分类似于胚胎干细胞、具有无限自我更新和分裂能力的类干细胞，调控肿瘤的发生发展[1～3]。常规的放化疗主要是针对普通的肿瘤细胞，而CSCs对此并不敏感。同时，随着放化疗的刺激作用及普通肿瘤细胞的清除，改变了CSCs的微环境，CSCs得到富集，增殖侵袭转移的能力进一步增强，并且对化疗药物表现出更强的耐药性，对药物的敏感性降低，甚至无反应，导致肿瘤的复发，说明CSCs在肿瘤耐药中发挥了重要作用。对CSCs耐药机制的研究将有助于肿瘤治疗新思路的开拓。研究[4]发现，CSCs主要通过自身的生物学特性和肿瘤微环境的保护作用而在肿瘤耐药中发挥作用，现将相关研究进展综述如下。

1 CSCs的生物学特性

美国癌症研究协会(AACRl3)定义CSCs为：肿瘤中能够自我更新，并产生异质性肿瘤细胞的细胞。研究[2,6]显示，将少量的CSCs种植于小鼠体内能重塑整个肿瘤的表型，因此常常导致肿瘤的复发、耐药和转移。和正常的干细胞一样，CSCs高表达干性基因NANOG、OCT4、SOX2等，还有干性信号通路的激活，以此维持CSCs的干性，调控肿瘤的发生发展。CSCs的生物学特性决定了CSCs不同于普通的肿瘤细胞。CSCs通常隐匿在癌巢中，处于静止状态，DNA复制不活跃，能够逃避化疗药物诱导的DNA损伤作用，对DNA损伤的修复能力增强，保持基因的稳定遗传。CSCs的这些生物学特性受到胞内和胞外复杂的调控网络的控制。

1.1 细胞周期阻滞 CSCs通常处于休眠状态，增殖不活跃。大部分的化疗药物主要是针对分裂中的肿瘤细胞，这些肿瘤细胞通常处于G2/S期，而CSCs处于G0/G1期，对化疗药物并不敏感。因放化疗的作用，消除了普通肿瘤细胞，使CSCs得到富集。同时，也因化疗药物的刺激作用，静止的CSCs迅速苏醒，进入细胞周期，迅速增殖分裂，重构整个肿瘤的表型，导致肿瘤复发。CSCs休眠状态需要自身特性和外部环境因素的共同作用的维持。在对胰腺癌CSCs的研究[7]中发现，耐药的肿瘤球体细胞中，细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶抑制剂P21和肿瘤抑制因子P53的表达升高，而细胞周期蛋白D1的表达降低，细胞周期停滞于G0/G1期，对普通化疗药物不敏感，常常导致肿瘤的复发。乙醛脱氢酶1(ALDH1)常常作为CSCs分选标志,可以将醛类氧化成羧酸类，抵抗烷化剂的损伤作用，高表达于CSCs表面。Meng等[8]发现，在卵巢癌CSCs中，ALDH1表达阳性的CSCs对化疗药物的敏感性明显降低，ALDH1A通过调节KLF4和细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶抑制剂P21蛋白调整细胞周期，细胞停滞于对化疗药物不敏感的G0/G1期，从而抵抗药物的杀伤作用。此外，糖原合成酶激酶-3(GSK-3)通过Wnt/β-catenin促进β-catenin泛素化，阻断下游靶标细胞周期蛋白-1、c-Myc等的激活，抑制细胞周期的进程。Haraguchi等[9]发现，生长分化因子15(GD15)可以通过AKT/GSK-3β/β-catenin信号通路增加肝CSCs在G0/G1期的细胞比例，增强肝CSCs的成球能力及对化疗药物的抵抗力。因此，细胞周期阻滞可以保护CSCs抵抗化疗药物的损伤，打破CSCs的休眠状态可以作为新的治疗方向。

1.2 DNA损伤耐受及DNA损伤修复 目前一部分化疗药物是通过诱导肿瘤细胞DNA损伤来发挥杀伤肿瘤细胞作用的，而CSCs不但处于休眠期，还具有极强的DNA损伤耐受及DNA损伤修复能力。其主要机制为，一方面通过切除修复去掉DNA受损部分，另一方面通过增强重组修复稀释损伤的DNA链。肿瘤化疗药物顺铂主要是抑制肿瘤细胞的DNA复制与转录，诱导细胞的凋亡。Srivastava等[10]发现，卵巢CSCs中高表达DNA聚合酶Polη，通过促进跨损伤DNA合成，跳过损伤的DNA复制点，可以逃避顺铂的损伤作用。此外，对DNA损伤的修复还可通过增强对DNA双链断裂(DSBs)的修复来完成。Gold等[11]发现，新型抗癌药物螺内酯抗肿瘤的作用机制，就是通过抑制肿瘤细胞的DSBs修复来完成的。因为螺内酯对完好的CSCs并不起作用，仅对发生DSBs的CSCs的DNA修复有抑制作用，解除CSCs的DNA损伤耐受、抑制CSCs的DNA修复，可以干扰CSCs的正常分裂，从而消除CSCs，抑制肿瘤的复发及耐药，提高肿瘤清除率。

1.3 药物外排 化疗药物发挥杀伤作用需要一定的药物浓度，CSCs与普通肿瘤细胞相比，细胞内的药物浓度较低，这与CSCs表面高表达多药耐药蛋白(MDR)有关。ABC转运蛋白家族是一类MDR，即ATP结合盒蛋白，能够利用ATP水解释放的能量将治疗药物排出胞外，从而降低细胞内有效的药物浓度，导致肿瘤的耐药及复发。此外，ABC转运蛋白还可作为肿瘤的预后因子，ABC亚家族C成员2(ABCC2)、ABCC3和ABC亚家族G成员2(ABCG2)作为CSCs的标志物，其表达与结肠癌患者的预后相关，可以作为结肠癌预后的预测因子。由于一种药物可由多种转运蛋白排出，单独抑制某一种特定的转运蛋白，无法阻碍药物的外排，这也是阻碍靶向药物成功运用于临床的一大障碍。Wu等[12]发现，靶向药物酪氨酸酶抑制剂tepotinib可以抑制ABCB1介导的药物外排，但是不能阻断ABCG2、ABCC1的外排作用。因此，进一步探究ABC转运蛋白的调控机制，对恢复抗肿瘤药物杀伤作用来说至关重要。

1.4 上皮间质转化(EMT) EMT，即上皮细胞失去上皮细胞的特性而表达间质细胞的特性，并获得侵袭转移的能力。EMT在产生CSCs中起着关键作用，与CSCs的生物学特性及耐药现象紧密相关。目前认为，一部分CSCs由已分化的肿瘤细胞去分化产生。Li等[13]研究表明，调控EMT过程的转录因子的上调，如snail、slug等，可以诱导已分化的肿瘤细胞去分化转化为CSCs，并介导化学抗性。Shuang等[14]发现，发生EMT的恶性肿瘤细胞，干性基因的表达有所增强，表明发生EMT能使肿瘤细胞去分化为CSCs，获得干性特征。与此同时，CSCs高表达间质细胞标志物。Wang等[15]发现，胰腺癌悬浮球培养的球体细胞高表达干性标志物CD44+、NANOG的同时，snail等EMT转录因子的表达也升高。Gao等[16]发现，在肝CSCs中CD44+的肝CSCs高表达间质细胞标志物波形蛋白和N-钙黏蛋白，而低表达上皮细胞标志物；去除CD44+CSCs,可以通过抑制ERK/Snai信号通路，减少肝癌细胞的转移。越来越多的证据[17,18]表明EMT与CSCs之间的直接联系，共同促进肿瘤侵袭、转移，调控肿瘤的发生发展。EMT是一个动态的、可逆的过程，因此，通过直接靶向作用某个或某几个EMT相关的转录因子，并不能抑制EMT的发生。探究EMT与CSCs之间的作用机制，对肿瘤的治疗来说是至关重要的。

2 CSCs生存的肿瘤微环境的特点

CSCs的耐药除了与其干性特征相关外，还受肿瘤微环境的调节。单个的CSCs无法独自存活，需要肿瘤微环境的支持。肿瘤微环境不仅包括肿瘤细胞本身，还有与肿瘤相关的基质细胞、微血管、细胞间质和细胞因子。肿瘤微环境是一种动态变化的环境，受肿瘤发生发展的调节。肿瘤的发生发展促肿瘤微环境的形成，微环境的低氧、低PH、微量葡萄糖供应进一步维持CSCs的干性和提高耐药能力。CSCs的休眠状态能够适应微环境中低能量供应，一旦环境发生改变，CSCs能量利用方式随之改变，进入增殖期扩增肿瘤细胞[19]。所以，CSCs所处的肿瘤微环境是维持干性、驱动肿瘤发展、复发及耐药的重要因素。同种肿瘤在不同肿瘤微环境中，其基因表达和生物学行为之间具有显著的差异性，可能与肿瘤微环境的差异相关。鉴于CSCs与肿瘤微环境相互作用关系，肿瘤微环境可以作为肿瘤治疗的新的靶点，改变CSCs生存的环境，增加对药物的敏感性。

2.1 低氧环境 低氧环境是肿瘤微环境的一大特点，是维持CSCs的干性的重要条件。低氧环境可以诱导CSCs的干性、促进EMT的发生以及产生更强的耐药。低氧环境下众多的信号通路处于激活状态，主要是由缺氧诱导因子-1(HIF-1)介导的一系列级联反应。HIF-1几乎参与细胞代谢的每个过程，涉及肿瘤的发生、转移、复发及耐药。在低氧状态下，HIF-1降解途径被抑制，导致HIF-1及其调节的靶基因如NANOG等在CSCs中的表达普遍高于非CSCs[20]。Sun等[21]发现，在低氧环境下，磷脂酰肌醇3-激酶(PI3Ks)/ATK信号通路的活化可以激活HIF-1α，提高CSCs抵抗化疗药物的能力。低氧环境还可以维持CSCs的休眠状态，抑制细胞凋亡，抵抗药物的杀伤作用。Li等[22]发现，HIF-2α在神经胶质细胞瘤干细胞中明显高表达，通过干扰HIF-2α的表达可以促进CSCs的凋亡。

2.2 肿瘤相关成纤维细胞(CAFs) 肿瘤微环境由肿瘤细胞及非肿瘤细胞构成，CAFs、巨噬细胞(M2细胞)是其中最重要的两种间质细胞，这些细胞能够分泌不同的细胞因子和生长因子，包括VEGF、IL-10和IL-17等，通过调节CSCs促进肿瘤的进展。CAFs受肿瘤微环境中成纤维细胞生长因子、TGF-β的作用而激活，分泌大量的细胞因子，调节CSCs的增殖、维持CSCc的干性。此外，CAFs分泌的Annexin A1还能够促进前列腺癌CSCs的增殖。Cazet等[23]发现，在肿瘤的异种移植实验中，与单纯移植CSCs相比，将CSCs和CAFs共同移植，其成瘤能力显著增强。此外，CAFs能够诱导已分化的肿瘤细胞去分化恢复CSCs表型。Vermeulen等[24]研究发现，由于CAFs分泌肝细胞生长因子(HGF),通过作用于酪氨酸激酶受体c-Met激活Wnt信号通路，使位于结肠癌边缘的肿瘤细胞表达更高的干性特征，导致结肠癌的耐药及复发。CAFs不仅能够维持CSCs的干性表型，同时自身高表达ABC转运蛋白,为CSCs创造相对低药物浓度的微环境。CAFs还能够诱导CSCs代谢的改变，影响肿瘤的发生发展。Renner等[25]研究发现，CAF分泌的细胞因子能够增强CSCs膜上的葡萄糖转运蛋白的表达，增加细胞对葡萄糖的摄取，供给细胞增殖所需的能量。Su等[26]发现在乳腺癌中，CAFs通过为CSCs提供适宜的微环境，促进肿瘤发展及耐药。通过靶向根除CAFs，破坏CSCs赖以生存的微环境，可以阻碍乳腺癌的发展，恢复对化疗药物的敏感性。因此，靶向作用于CAFs可以作为一种有效的治疗策略。

2.3 慢性炎症 虽然早期的炎症反应能够联合机体的免疫系统抑制肿瘤的形成，慢性炎症却是肿瘤扩张的主要诱因。Kim等[27]发现,IL-6作为免疫和炎症反应的调节剂，可以通过IL-6-JAK1-STAT3信号通路的激活靶向OCT4基因，导致CSCs增殖，诱导非肿瘤细胞转化为CSCs。慢性炎症还会造成低氧的环境。Manupati等[28]研究发现，表皮生长因子EGFR通过环氧化酶-2(COX-2)调节乳腺癌CSCs的自我更新。研究[29]表明，慢性炎症与CSCs相互促进，如核因子κB-(NF-κB-)介导的炎症反应增加了肿瘤细胞的干性，而CSCs表达NF-κB-的水平升高，进一步促进炎症的形成。最新的研究[25,30]表明，肿瘤细胞免疫逃避和糖代谢增强是相互关联的，并受肿瘤微环境的调节。癌症相关的免疫细胞，例如巨噬细胞，由于肿瘤微环境中的缺氧状态，细胞产生大量的乳酸，而过量的乳酸可以使得MI型的巨噬细胞转化为M2型的巨噬细胞，M2型的巨噬细胞可以分泌TGF-β1、EGF等细胞因子，诱导CSCs的增殖，增强CSCs的侵袭转移能力，进一步促进肿瘤的发生发展。因此抗肿瘤治疗中辅以抗炎治疗，可以打破CSCs依赖的生存条件。

综上所述，细胞周期阻滞、DNA损伤耐受及DNA损伤修复、药物外排、EMT等CSCs的生物学特性，低氧环境、CAFs、慢性炎症等肿瘤微环境的特点，共同维持CSCs的干性特征,抑制化疗药物对CSCs的刺激作用，加大了肿瘤治疗的困难性。通过对CSCs耐药机制的研究可以指导开发新的针对CSCs的靶向治疗，联合传统的治疗策略，同时消除CSCs和肿瘤细胞，提高肿瘤的治疗效果。