纤维素酶基因的研究进展

王 伟 （广东永顺生物制药股份有限公司 广东 广州 510000） 王永花 （山东省蒙阴县科技局）

纤维素酶作为重要的糖苷水解酶，对纤维素有较好的水解作用。目前已知的天然纤维素酶已广泛应用于各方面，但其产量难以达到生产需求，造成了大量资源的浪费。为了充分利用纤维素资源，获得高产的纤维素酶菌株，目前国内外对纤维素酶基因工程的研究已成为热点。本文对纤维素酶基因及其表达系统进行综述，总结近几年来纤维素酶基因工程的研究进展，为后续研究提供依据。

纤维素酶来源广泛(细菌、真菌、动物体内)，其中细菌产生的纤维素酶是胞内菌且活性低，产量低，种类单一。真菌则能够分泌大量的胞外纤维素酶，而且酶的种类齐全，其中对木霉属、曲霉属和青霉属[1]研究最多。现已知的纤维素酶其基因的表达通常受多种因素的影响和制约，产量较低，难以满足工业生产。在此基础上人们尝试将纤维素酶基因和高效的启动子融合，改变纤维素酶基因的表达方式，使其异源或同源表达，显著的提高了纤维素酶的产量，这将是提高纤维素酶生产效率的有效途径。近几年来分子生物学、基因工程技术发展较快，对纤维素酶分子层面的研究也在不断深入，其中纤维素酶基因的克隆与表达成了研究的焦点。

1 纤维素酶研究进展

1.1 纤维素酶简介

纤维素酶是由三中不同种类的酶组成的复合酶，并且各种酶之间相互协同，将纤维素最终水解为葡萄糖。纤维素酶的分类有三种：

1.1.1 内切葡聚糖酶 不同的来源名称不同，明该类酶主要作用于纤维素分子内部的非结晶区，来自细菌的叫Cen，真菌的叫Eg。有研究表并且对CMC-NA等这种无定型纤维素的非定型区具有水解作用[2]。

1.1.2 外切葡聚糖酶 该酶又可分为β-1，4-D葡聚-葡萄糖水解酶和纤维二糖水解酶。其中β-1，4-D葡聚-葡萄糖水解酶是纤维素酶体系中的重要组成部分，对微晶纤维素和结晶度高的纤维素的水解起主导作用。

1.1.3 β-葡萄糖苷酶 它主要分解纤维二糖和纤维素糊精的非还原末端，水解葡萄糖残基生成葡萄糖。

1.2 纤维素酶的应用

21世纪以来，我国人口数量不断上升，畜牧业集约化水平也在不断提高，但资源短缺的现象却日益显现。面对资源匮乏的严峻形势，纤维素类物质却被大量浪费：焚烧，丢弃…这些做法既污染了环境又造成了资源大量的流失。为了避免纤维素资源的浪费，目前纤维素酶已被广泛地应用于食品、酿酒、饲料加工、纺织、洗衣、农业等多个领域中[3]。

1.2.1 食品工业的应用 将纤维素酶应用于果实和蔬菜加工过程，不仅可以避免果蔬香味和维生素的损失，而且可使植物组织软化膨松，提高可消化性并改良口感。在油料作物加工中用纤维素酶处理法代替有机溶剂法，不仅能提高油的产量和质量，还能减少副产物的生成和降低废物处理费用[4]。除此之外，纤维素酶还被广泛应用于茶叶加工、食醋酿造、酱油酿造和啤酒生产等行业中。

1.2.2 饲料工业的应用 纤维素酶在畜牧业和饲料工业上也发挥着重要的作用。纤维素酶作为外源酶添加到动物日粮中，能很好的提高动物对饲料的消化率和转化率，而且也能够缓解目前能量饲料短缺的局面。在饲料中添加纤维素酶后，喂养效果明显，喂蛋鸡可提高产卵量，喂乳牛时，不仅体重增加，产乳量也显著上升。程松峰等[5]在断奶羔羊的日粮中放入纤维素复合酶，然后与未加纤维素酶的一组进行比较，结果发现加纤维素酶一组的羔羊平均日增重提高到了4.22%，料重比降低了5.2%。在肉鸡的日粮中拌入纤维素酶复合物可使肉鸡饲料消耗总量下降16.15%，肉鸡体重增加2.78%，料肉比降低10.08%。

1.2.3 其他方面的应用 纤维素酶也广泛的应用于造纸、洗涤、草药提取、生态农业等方面。碱性纤维素酶作用于洗涤工业，改善了去污机制，与之前洗涤剂相比，去污能力有了很大的提高。纤维素酶也可作用于天然植物的降解，不仅节约了资源，环境也得到了很大的改善。

2 纤维素酶及其基因的研究进展

2.1 纤维素酶的研究概况

纤维素酶在19世纪就已经被发现，并且随着技术的发展，人们在蜗牛的滑液中发现了具有分解能力的纤维素酶。纤维素酶的发展主要经过了以下几个阶段：1980年以前，主要采用传统分离纯化的方法培养产纤维素酶的微生物，并且在培养的过程中对纤维素酶有了更近一步的认识；到了八九十年代，主要研究纤维素酶基因，利用基因工程的手段对基因进行克隆与表达；近年来，在蛋白组学、宏基因组、基因组学的研究背景下，对纤维素酶分子的内部结构和功能研究较多，并且对纤维素的酶解机理有了更深入的了解。

2.1.1 国外研究 早在100多年前，Bary．A和Ward Marshall就在真菌中发现了纤维素酶。1906年，Seillicre在蜗牛的消化液中发现了有分解能力的纤维素酶。1912年，Pringsheim首次从嗜热性纤维素细菌中分离出纤维素酶，从此揭开了纤维素酶研究的序幕。20世纪40-50年代，在对产纤维素酶微生物分离筛选的过程中，建立起较为完整的分离筛选方法。20世纪60年代后期，分离技术的发展推动了纤维素酶的分离纯化工作，加快了纤维素酶的组分、作用方式及诱导作用等方面的研究进展，实现了纤维素酶制剂的工业生产。20世纪70年代，有些学者提取到了3种酶，并且发现这3种酶协同作用下可以提高纤维素酶的活性。1997年，韩国和美国学者对里氏木霉及5株温度突变菌株产纤维素酶的条件进行研究，指出由于多种酶的协同作用，葡萄糖的产率比单独的纤维素酶作用的总和高1.5～8倍。

2.1.2 国内研究 我国在1960年就开始了对纤维素酶的研究，随后北京、上海等地的科研院所对纤维素酶进行了大量的研究，并且选育出一批纤维素酶菌种。1968年，北京选育出一批纤维素酶菌种。1970年，中国科学院上海植物生理研究所用诱变方法获得了产酶能力较高的变异株。1975年，广东省微生物研究所分离筛选出纤维素酶产生菌株—长梗木霉。20世纪90年代，在沈阳农业大学陈祖洁教授和曹淡君教授的亲自指导下，黑龙江省海林市万力达集团公司首条年产2000t纤维素酶生产线投产，实现了纤维素酶的工业化生产。

2.2 纤维素酶基因的研究现状

（1）20世纪80年代，DNA重组技术发展迅速，并广泛用于基因的研究，其中编码Eng和Exg的胞外纤维素酶基因被研究较多。2009年，Rahman[6]等用T.reesei的cbh1启动子和终止子构建表达载体来制备同源和异源性蛋白质。2011年，华南理工大学将构建的随机整合型pWEF3基因和定点整合型pWEF32基因通过农杆菌介导转入里氏木霉，发现pWEF31适合用于随机性的重组试验，而pWEF32适用于同源性重组。Anthony等[7]2012年第一次在C. biazotea中发现了GH1家族中由新型纤维二糖酶基因编码的β-葡萄糖苷酶。（2）随着现代科学技术的发展，获得完整纤维素酶基因的方法也在不断地进步。人们将细菌或真菌的纤维素酶基因放在异源菌(大肠杆菌或酵母细胞)中进行表达。李旺等[8]总结，在纤维素酶基因研究和克隆的早期，若想获得纤维素酶基因较完整的信息，可通过构建DNA文库和cDNA文库的方法。而随着技术的进步，目前可采用人工合成和选择性的从宏基因组中扩增等方式获得纤维素酶基因。

3 纤维素酶基因工程的研究进展

目前，虽然天然产纤维素酶的菌株有很多，但其产酶量低，产酶条件严苛，难以大规模的应用于生产[9]。在此基础上，人们尝试对基因进行克隆、异源表达来改造产纤维素酶菌株，以获得产酶量高、活性高、易培养的工程菌[10，11]。

3.1 纤维素酶基因克隆

（1）在当今科技发展的背景下，基因的克隆技术取得了突飞猛进的进展。基因克隆的方法已由构建DNA文库或cDNA文库，进步为人工合成法、特异性引物扩增法，而且许多目的基因可以通过特异性引物从某一区域的宏基因组中克隆获得。（2）到目前为止，7000多个纤维素酶基因序列及其相应的氨基酸序列被发现并记录在Gen Bank，EMBL等共享数据库中。同时，目前所能克隆到的纤维素酶基因都实现了异源表达。如：在毕赤酵母中成功表达了来源于枯草芽孢杆菌的纤维素酶基因；放线菌的纤维素酶基因Cel6A 和Cel6B实现了在烟草中的表达；从白蚁中克隆的纤维素酶基因在大肠杆菌中的表达等等。

3.2 纤维素酶基因原核表达系统

（1）原核表达系统是基因表达技术中发展最早，应用最广泛的经典表达系统。与其它表达系统相比，具有目的基因表达水平高，培养周期短，抗污染能力强，成本相对低等特点。常用的原核表达系统有大肠杆菌表达系统和枯草芽孢杆菌表达系统。（2）黄艳等[12]从康氏木霉中克隆得到纤维素酶EGⅠ基因，并通过表达载体pETHis成功转入大肠杆菌。王万能[13]利用反转录PCR法，从福寿螺中克隆出纤维素酶基因CelAg，将其与载体pET-30a(+)连接并转化至大肠杆菌BL21(DE3)，通过检测得到重组菌的纤维素酶活达8.31U/ml。任慧杰等[14]将得到的松材线虫纤维素酶编码基因BXC46，克隆到表达载体pET-15b上，通过大肠杆菌BL21(DE3)菌株进行表达，其中部分纯化的重组蛋白具有纤维素酶的活性。阮涛等[15]从绿木霉ZY－01中克隆得到了外切葡聚糖酶CBHI，并将其转化至大肠杆菌中，成功获得了CBHI可溶性蛋白。（3）大肠杆菌作为表达系统，水平很低，而且产生的纤维素酶大部分不能分泌到胞外，提取有很大的困难，无法达到纤维素酶生产的要求。枯草芽孢杆菌不仅在临床等方面的应用上具有安全性，而且可以直接高效的分泌目的蛋白。李方正[16]将1株全长1518bp的枯草芽孢杆菌EG基因，通过表达质粒pMG36e-EG电转化至乳球菌MG1614感受态细胞，成功构建了产内切纤维素酶的基因工程乳酸菌。刘晖[17]将内切葡聚糖酶基因Tv-EgVⅡ和葡萄糖苷酶基因An-BglⅠ与大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭表达载体PMA5连接，并将重组质粒转化到枯草芽孢杆菌168内，获得了遗传性能稳定、产纤维素酶较高的基因工程菌。

3.3 纤维素酶基因真核表达系统

（1）真核表达系统与原核表达系统相比有其优点。真核系统更容易诱导基因的高效表达，而且不会发生基因之间的非特异性激活或抑制，利用真核表达系统来表达目的蛋白越来越受到重视。目前，基因工程研究中常用的真核表达系统有酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统。（2）木霉本身不但能合成纤维素酶，而且还能作为外源基因的表达系统，其具有成熟的发酵技术和较强的蛋白质胞外分泌能力[18]。在此基础上，Takashima 等[19]分别从腐质霉和木霉中克隆了纤维素酶基因，并将这些纤维素酶基因转化到米曲霉中，实现了这两个基因在真核宿主中的高效表达，并获得了异源纤维素酶。（3）纤维素酶基因在异源宿主表达的过程中容易遇到蛋白水解酶和糖基化等问题，这使得酵母菌成为表达的首选菌，它不仅可以使表达出的蛋白具有生物活性，而且酵母本身分泌的蛋白成分很少，利于表达蛋白的分离纯化，是目前较为理想的真核表达系统;此外，酵母菌繁殖速度快、营养要求低、培养基价格低廉，更有利于工业化生产[20，21]。Zhuge等[22]成功将来源于细菌的纤维素酶基因转化到毕赤酵母中，实现了原核细菌基因在酵母中的表达。张煜等[23]采用毕赤酵母表达系统进行了瑞氏木霉CBHⅡ基因的表达。田生礼等[24]将从嗜碱性芽孢杆菌ATCC21833中扩增得到的碱性纤维素酶基因，与酵母整合型表达载体pGAPZaA连接，并转化至巴氏毕赤酵母GS115，成功构建了表达碱性纤维素酶的毕赤酵母工程菌。黄时海等[25]克隆了康氏木霉CBHⅠ基因，并在毕赤酵母中成功表达，检测表达产物其酶活达到24.1U/L。（4）酵母表达系统具有将纤维素的最终分解产物—葡萄糖转化为酒精的能力，如果能将纤维素酶系的基因克隆到酵母表达系统中，可以实现从纤维素到葡萄糖再到酒精的完整发酵过程，成为纤维素酶基因工程发展的一个重要方向。王利英等[26]反转录得到葡聚糖内切酶EGⅠ和EGⅢ基因cDNA，将其克隆到酵母载体中，成功构建了产生纤维素酶的酿酒酵母工程菌。

4 总结

（1）从发现纤维素酶至今，人们将注意力集中至高产酶量菌株的选育工作中，并且已取得了重要进展，但是因为选育的许多菌株产酶活性低、菌种易退化等问题使纤维素酶的工业化生产受到限制。因此，人们把注意力转移到纤维素酶基因上，利用基因工程技术对纤维素酶基因进行克隆和异源表达，为构建高效纤维素酶分解菌等方面开辟了新途径。（2）随着生物及工程技术的发展，纤维素酶基因工程的发展也日新月异。为了更好地利用自然界中丰富的纤维素资源，人们对纤维素酶基因工程的研究还在继续。相信在不远的将来，会有更先进的技术来探索纤维素酶基因。