铁皮石斛组培苗规范化生产标准操作规程(SOP)＊

韦荣昌，闫志刚，施力军，吴庆华，黄芩芬，农定霖，覃 芳＊＊

（1. 广西农业科学院 经济作物研究所 南宁 530007；2. 广西药用植物园 南宁 530023；3. 广西西林县科技发展中心 西林 532500）

铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）是兰科（Orchidaceae）石斛属多年生附生型草本植物，因其茎节处呈黑褐色，故又名黑节草[1]，主要以茎入药，是我国传统名贵中药材[2]，也是广西著名道地药材[3]，始载于《神农本草经》，列为上品，有“救命仙草”、“植物黄金”之美誉。铁皮石斛性微寒，味甘，归肾、胃经，主要活性成分为多糖和甘露糖，具有清热滋阴、生津益胃的功效，广泛应用于临床、中药复方和保健品中，主治烦渴口干、津伤热病、胃阴不足、火旺阴虚、干呕食少、目暗不明、骨蒸劳热、筋骨痿软、病后虚热不退等症[4]。

铁皮石斛主要产地为广西、云南、浙江、四川、福建和安徽等区域，多生于海拔1600m 的树干或岩石上[5]，然而，由于种子产量极低（每个蒴果约有2-3 万粒），且缺乏胚乳，种子需与真菌共生才能萌发，因而自然萌发率较低，不足5%[6]，加之生境破坏和过度采挖，野生资源日渐枯竭，已被列入国家第一批《中国珍稀濒危保护植物名录》[7]。鉴于此，利用组织培养进行铁皮石斛的种苗繁育，既可保护自然资源，又能满足生产需求。为了进一步规范铁皮石斛组培苗的生产流程，以提高其质量，笔者遵循《中药材生产质量管理规范》（GAP）的指导，在深入产区调研的基础上，对各个生产环节进行试验验证，最终制定出铁皮石斛组培苗规范化生产标准操作规程。

1 范围

本规程规定了铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo)组培苗规范化生产的物种选择、种质特征、生态习性、组织培养、瓶内炼苗、移栽炼苗、出圃、装框、运输和档案记录。

本规程适用于广西壮族自治区境内铁皮石斛组培苗的规范化生产。

2 引用标准

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

①GB 3095 环境空气质量标准；GB 5084 农田灌溉水质标准；

②NY/T 394绿色食品肥料使用准则；

③GB 4285农药安全使用标准；

④GB/T 8321（所有部分）农药合理使用准则。

3 物种选择

兰科石斛属植物铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）。

4 种质特征

多年生附生草本。茎圆柱形，不分枝，具多节。叶基部下延为抱茎的鞘。总状花序具2-3 朵花，生于落了叶的茎上。花序轴回折状弯曲；花苞片小，膜质，浅白色。萼片和花瓣黄绿色；唇瓣白色，长圆状披针形，不明显3裂，基部两侧具紫红色条纹。唇盘密布短毛，中裂片白色并且具有1 个横生的深紫色斑块。花期3-6月[8]。

5 生态习性

主要分布在亚热带地区，分布中心位于北纬30°与北回归线之间，海拔100-3000 m，以800-1500 m为佳，性喜温凉、湿润、多雾、通风、透气、透水、昼夜温差大、夜间湿度高的环境，自然透光度要求在20-50%，光照一般为漫射光、散射光，光照强度为1500-2000 lux，光强过强或过弱均会影响铁皮石斛的产量和品质。其中，温度为最主要的限制因子，25℃左右为最适生长温度，通常超过35℃即停止生长，而温度过低则会导致植株的冻伤或冻死。铁皮石斛喜湿而又怕水渍，最适空气湿度为60-80%，根部周围含水量宜在50%左右，水分过多会导致烂根[9-11]。

6 组织培养

6.1 外植体的选择与消毒

当果皮由绿色转呈淡黄色时，选择饱满未分裂的蒴果作为外植体，用质量分数为2%的洗洁精水溶液浸泡5-10 min，再经线状流水冲洗15-30 min；移至超净工作台上，用添加了2-3 滴吐温-20 的质量分数为0.1%的升汞消毒8-10 min，然后用无菌水冲洗3-5 次（每次≥10 min），再用消毒滤纸或吸水纸除去表面水分，得到无菌外植体[12]。

6.2 无菌试管苗的制备

在超净工作台上，用解剖刀将经消毒的蒴果纵向切开，再用镊子夹紧蒴果的一端轻轻抖动，将种子均匀地散布于种子萌发诱导培养基（1/2MS+0.3mg⋅L-1NAA+4.5 g⋅L-1琼脂+30 g⋅L-1蔗糖+20%马 铃薯泥，pH 值为5.8）上，在培养温度为24-26℃，光照强度为1500-2000 lux，光照时间为每天12h的条件下连续培养30天，诱导种子萌发，获得无菌试管苗。

6.3 原球茎增殖与分化

将种子萌发获得的原球茎接种于增殖与分化培养基（1/2MS+1.0 mg⋅L-16-BA+0.1 mg⋅L-1NAA+4.5 g⋅L-1琼脂+30 g⋅L-1蔗糖+2%活性炭，pH 值为5.8）中，在培养温度为24-26℃，光照强度为1500-2000 lux，光照时间为每天12h 的条件下连续培养45 天，诱导原球茎增殖与分化[13]。

6.4 试管苗生根培养

将经增殖与分化的试管苗接种于生根培养基（1/2MS+0.5 mg⋅L-1NAA+4.5 g⋅L-1琼脂+15 g⋅L-1蔗糖+15%香蕉泥，pH 值为5.8）中，在培养温度为24-26℃，光照强度为1500-2000 lux，光照时间为每天12h的条件下连续培养30-45天，诱导试管苗生根。

7 瓶内炼苗

获得带根的完整植株后，将瓶苗置于自然环境中适应2-3 周，逐渐增加光照强度。然后将瓶苗转至室温为25℃的室内，打开瓶盖，在瓶中加入少量自来水，炼苗2-4天，待表面角质形成后将苗取出，用自来水洗净根部培养基，待移栽。

8 移栽炼苗

8.1 搭棚建畦

选择地势高、远离污染、背风向阳、排灌良好、交通便利、易于管理的地块，搭建温室大棚（空气应符合GB 3095 环境空气质量标准；灌溉水应符合GB 5084农田灌溉水质标准）。覆盖材料选用透光性强、保温性好的阳光板或塑料薄膜。棚内配备遮阳网、防虫网，以及喷淋、控温和调湿设备。

搭建宽100-140 cm 的畦，畦底离地架空50-70 cm。畦面用竹片、木板或塑料平网等作为基质的支撑面，畦上方50-100 cm处安装定时雾化喷嘴[14]。

搭棚建畦准备就绪，再密闭大棚，用熏蒸剂消毒处理后方可投入使用。

8.2 苗床准备

选择疏松透气、保湿透水、不易发霉、无病菌和害虫潜藏的水苔、刨花、椰丝、菌糠、木糠等作基质。先用蒸煮、日晒、堆沤和浸泡等方法进行基质消毒，然后调整基质含水量至50-60%。将基质铺于畦面上，摊平，整成厚8-10 cm 的炼苗床。移栽前，以多菌灵1000倍液或0.3%高锰酸钾喷洒基质。

8.3 移栽

当日平均气温为15-30℃时，即可出瓶移栽。株行距为4 cm×5 cm或5 cm×5 cm，在基质上挖2-3 cm深的孔洞，将铁皮石斛幼苗根部小心放入洞中，然后用基质覆盖，稍压实，淋足定根水[15]。

8.4 苗期管理

8.4.1 补苗

移栽后15天，全面检查，若发现死亡缺株，及时拔除并补以适龄小苗。

8.4.2 水分管理

保持基质含水量为50-60%，空气相对湿度为70-80%。如遇高温干旱，可于早晚喷雾降温；多雨季节应及时清沟排水，降低湿度。

8.4.3 光照管理

采用遮阳网降低光照，前期遮光率为70-80%，后期遮光率为60-70%。

8.4.4 温度管理

保持大棚内白天气温25-30℃，夜间15-20℃。高温季节，及时通风散热，喷雾降温；低温时节，密封大棚，必要时覆膜保温，以免小苗冻伤。

8.4.5 追肥除草

遵守NY/T 394绿色食品肥料使用准则。移栽后7天，叶面喷施1/4MS 营养液，连喷4 次。此后，每15 天用磷酸二氢钾叶面追肥1 次，并用腐熟有机肥撒施根部。根据杂草生长情况，及时除去畦面杂草，并对外露的根部进行覆盖。

8.5 病虫害防治

主要病害有黑斑、炭疽、白绢等病，主要害虫有斜纹夜蛾、短额负蝗、软体动物等。遵循“预防为主，综合防治”的植保方针，优先采用农业防治、物理防治、生物防治，合理使用高效低毒低残留化学农药（应符合GB 4285 农药安全使用标准和GB/T 8321（所有部分）农药合理使用准则），将有害生物造成的损失控制在经济允许阈值内。

8.5.1 黑斑病

3-5 月，为害嫩叶，出现黑褐色斑点，斑点四周呈黄色，严重时枯萎脱落。可用1∶1∶150的波尔多液，或10%的多菌灵1000 倍液，或10%世高水分散粒剂800倍液～1000倍液喷雾，连用2-3次。

8.5.2 炭疽病

1-5 月，为害叶片，呈现黑褐色病斑，严重时叶片脱落。可用50%施保功可湿性粉剂2000 倍液，或65%代森锌600 倍液，或80%炭疽福美可湿性粉剂800倍液，每隔7-10天喷雾1次，连用2-3次。

8.5.3 白娟病

基部先腐烂，逐渐扩至茎、叶。一旦发现病株，立即拔除烧毁，并用生石灰粉处理病穴，或50%福多宁可湿性粉剂3000 倍液，或75%灭普宁可湿性粉剂1000倍液喷雾，每隔7天喷1次，连用2-3次。

8.5.4 斜纹夜蛾

7-10 月，为害嫩芽和嫩叶。以性诱剂、杀虫灯等诱杀；清除初孵幼虫群集的“纱窗叶”或卵块；幼虫低龄期，用5%抑太保乳油1500 倍液，或10%除尽乳油1500 倍液，或20%杀螨乳油1000-1500 倍液等喷雾，每隔7天喷1次，连用1-2次。

8.5.5 短额负蝗

取食叶片，严重时啃光整叶。可用50%辛硫磷乳油1000-1500倍液喷杀。

8.5.6 软体动物

蛴螬、蜗牛、蛞蝓和某些螺类，为害嫩叶和幼茎，通常白天潜伏阴处，夜间爬出取食，雨天为害更重。可用青草或菜叶独饵诱杀，即用50kg 鲜草加50%辛硫磷乳油0.5kg，拌湿，于傍晚撒在畦间诱杀；或在畦四周撒施生石灰，防止其爬入畦内为害。

9 出圃

当苗高5-8cm，根长4-6cm，根数3-5 条，肉质茎具3-4节间，真叶4-5片时，即可出圃。

10 装框

将小苗及其根部基质，慢慢挖起，整齐装入无毒、无污染的竹筐或塑料筐内，并在框外贴附种苗标签，标注种苗名称，质量指标，种苗经营许可证编号，检疫证明编号，生产日期，生产单位名称及地址等。

11 运输

运输前做好植物检疫，向外调运应附有病虫害检疫合格证书，手续随车同行；将苗有序叠放，不能过度挤压、随意堆叠；长途运输应有防风、防晒、防雨措施，尽量在夜间进行，避免高温烧苗。

12 档案记录

详细记录组织培养、瓶内炼苗、移栽炼苗、出圃、装框、运输和档案生产技术、病虫害防治等各环节所采取的措施，并建立生产档案。