中风病急性期痰热证与MMP-2 表达的影响＊

郭春莉，付 强，高 颖

（1.中国中医科学院西苑医院 北京 100091；2.中国标准化研究院 北京 100191；

3.北京中医药大学东直门医院 北京 100700）

中风病是严重危害人类健康的常见病，具有发病率高、致残率高、死亡率高和复发率高的特点，已成为我国农村和城市人口第一位致残和死亡的原因[1]。临床证据表明，中药对缺血性卒中治疗有效，其主要是通过干预证候达到改善或治疗疾病，临床研究提示，中风急性期约有40%-50%的病人表现出痰热证，中医药对中风病急性期痰热证的治疗也突显优势，MMP-2在血清中的含量可以反应神经细胞的坏死程度，也可以反映神经细胞周围的浓度，也对判断治疗效果有一定帮助。MMP-2与中风病急性期痰热证是否存在相关性，其相关性研究能否形成微观辨证的依据，以及能否成为证候诊断及疗效评价的依据对中医药治疗中风病具有重要的意义。

1 研究资料和方法

1.1 临床资料

本研究数据来源于2013 年8 月-2015 年5 月发病7天内就诊于中国中医科学院西苑医院的缺血性中风痰热证患者45 名，非痰热证44 名，发病年龄均为35岁-85岁。

1.2 筛选中风病急性期受试者

1.2.1 疾病诊断

疾病诊断标准参照2005年卫生部疾病控制司、中华医学会神经病学分会颁布的《中国脑血管病防治指南（试行版）》的脑梗塞诊断部分。

1.2.2 证候诊断

证候诊断标准参照973 计划“缺血性中风病证结合的诊断标准与疗效评价体系研究”课题组制定的《缺血性中风证候要素诊断量表》。

1.2.3 纳入标准

符合疾病诊断标准；起病7天以内；年龄≥35岁且≤85岁者。

1.2.4 排除标准

蛛网膜下腔出血者；年龄小于35 岁或大于85 岁者；病程超过1 周的急性脑血管病患者；既往有肿瘤、造血系统疾病者；有精神性疾病患者；不配合者；资料不全影响结果判定者。

1.3 临床信息采集

所有入选受试者均填写统一表格，表格内容主要是人口学资料（指调查患者的个人信息，包括患者姓名、性别、出生日期、家庭住址、联系电话等）、病史调查（既往史、家族史、过敏史、生命体征、一般内科情况、神经系统检查等），中风病急性期受试者并填写病例观察表、中风病证候要素诊断量表，分为痰热组和非痰热组，均于入院后第1日清晨空腹取血，采用酶联免疫吸附法测定血清MMP-2水平。

1.4 研究方法

1.4.1 证候量化评定

经过统一组织的量表使用培训后，由纳入之日由脑病科医师使用《缺血性中风证候要素诊断量表》，对每例患者分别作出内风证、内火证、痰湿证、血瘀证、气虚证和阴虚证的量化诊断（得分≥10分诊断成立）。

1.4.2 受试者血清MMP-2的测定

在缺血性中风病起病第7 d采肘静脉血10 mL，留取标本后尽快注入EDTA 抗凝管内，4℃、3 000 r·min-1离心10 min，吸取上清液，-20℃至-80℃保存待测。采用双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA 法），检测血清中MMP-2的含量（ng·mL-1）。具体操作步骤如下：

1）标准品的稀释与加样：标准品按照说明书稀释好五个梯度，各个梯度每孔加样量都为50 μL，

2）加样：分别设空白孔、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40 μL，然后再加待测样品10 μL。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3）温育：用封板膜封板后置37℃温育30 min。

4）配液洗涤：将30（48T 的20 倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T的20倍）倍稀释后备用；小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 秒后弃去，如此重复5次，拍干。

5）加酶：每孔加入酶标试剂50 μL，空白孔除外。6）温育：用封板膜封板后置37℃温育30 min。7）洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 s后弃去，如此重复5次，拍干。

8）显色：每孔先加入显色剂A50 μL，再加入显色剂B50 μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15 min。

9）终止：每孔加终止液50 μL，终止反应。

10）测定：以空白空调零，450 nm波长依序测量各孔的吸光度（OD 值）。测定应在加终止液后15 min 以内进行。（主波长450，辅助波长630）

1.5 统计学方法

应用SPSS 17.0版本，组内数据分析采取独立样本t检验，组间分析采取单向方差分析的方法。

2 研究结果

研究结果显示，痰热组MMP-2的表达较非痰热组MMP-2表达增强，具有统计学意义。

3 讨论

中药对缺血性卒中治疗有效，主要是通过干预证候达到改善或治疗疾病，因此证候的规范化研究一直是中风病诊疗研究的重点和难点。

“辨证论治”被认为是中医学术思想的精髓，已经成为指导中医临床诊断和治疗的基础。1955年，任应秋先生发表了《中医的辨证论治的体系》的一文，首次明确提出“辨证论治”这个概念，“辨证论治是中医临床上不可缺少的基本知识，所以张仲景的伤寒论和金匮要略两书数十篇，无一篇不贯以病脉证并治或病脉证治的题目，但中医的证候决不同于西医的症状，中医的证候完全是施治用药的标准，而西医的症状，不过是描写病人的异常状态，殊非诊断治疗上的关键；中医的辨证论治，注意于生体病变的全身证候，务使生体的生活机能恢复其正常状态，也就是说要把病证整个病理机转一变而为生理机转。”[“2]辨证”就是对病人四诊所收集的临床信息进行概括、判断为某种证候，是论治的前提和依据，“论治”是根据辨的证候来确定治法和处方谴药，因此“证候”是连接中医学理论和临床研究的核心与关键问题。传统中医只能依靠望、闻、问、切来获取患者的临床信息等病情资料，临床信息分辨率低、信息量小，模糊性大，信息收集过程中主观性很大，而且受到个人师承、临床经验、认知水平和方法及不同时代的不同，导致辨出的证候差别很大，使得辨证的精确性和重复性较差，影响了研究结论的真实性和可靠性，而且证候的概念模糊不清，表现出对证候名称及其内涵描述的经验化和随意性。证候与病名、症状等术语的划分不严格，称谓的繁杂，内容交错，随意性较大，缺乏统一的标准。中医证候描述的不确定性和缺乏规范性，这使中医学在现代社会中的应用与发展受到了很大的制约，不利于中西医理论与临床的相互沟通与交叉渗透，不利于自身的学术交流与对外交流。另外，在疗效评价方面，证候的疗效评价也起到了至关重要的作用，一些专家认为不对证候疗效评价，就是失去了中医的特色和优势，将会使中医辨证论治个体化治疗的优势得到削弱。如刘凤斌等认为“证”是中医诊断与疗效评价的核心所在，撇开“证”的改善，完全用西医的指标体系评价中医的疗效，无异于本末倒置，不利于中医药的发展[3]。因此，辨证论治的核心地位的确立，对证候规范化提出了新的需求。

基质金属蛋白酶（MMPs）是降解细胞外基质的蛋白酶类之一，其编码基因具有同源性，依据基质金属蛋白酶受体(MMPR)的组织特异性不同可分为：MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9 等等。MMP-2 作为MMPs 经典成员，可由机体内多种细胞分泌，活化后可以有效地降解Ⅳ型胶原和纤维粘连蛋白，也对细胞和组织的修复及伤口的愈合有重要影响[4]。MMP-2还具有调节凝血因子和补体的作用，当其表达升高同时，可以引起机体的纤维蛋白溶解系统的机制失调，使脑血管病的发生率升高。因此，MMP-2在血清中的含量可以反应神经细胞的坏死程度，也可以反映神经细胞周围的浓度，也对判断治疗效果有一定帮助。

临床研究提示，中风急性期约有40%-50%的病人表现出痰热证，痰为气血津液代谢紊乱的产物，为有形之邪，具有黏稠重浊之性，易与火热相结，二者交结难解，不易变化。便秘便干、舌苔黄腻、脉弦滑构成中风病急性期痰热证的基本证候特征及辨证要点[5]。王永炎院士指出中风病急性期病机错综复杂，证候变化多端，病势发展迅猛，难以驾驭，且变证坏证频见，极易产生神昏、窍闭、厥脱等，为难治重证，提出了“毒损脑络”中风病机理论的观点。中医药对中风病急性期痰热证的治疗也突显优势。

大量临床实践证明痰热证是中风病急性期的常见证候，痰热证的证候演变特点及其与神经功能缺损程度密切相关，中医药主要是通过干预中风病痰热证证候因素以改善症状或治疗疾病。本研究结合前期研究的基础上，以王永炎院士提出的“证候概念及其属性”理论为依据，以痰热证与基质金属蛋白酶相关亚型的关系为切入点，发现中风病急性期痰热证的MMP-2的表达明显增高，其相关性研究可以形成微观辨证的依据，其成为证候诊断及疗效评价的依据对中医药治疗中风病具有重要的意义。但该研究受样本量小的局限，试验结论可能存在一定的误差，今后可以扩大样本量、并增加对MMPs诸多亚型的进一步研究，为循证医学研究提供更加客观的数据支持。

通过总结分析MMP-2 与中风病证候之间的相关性分析，为证候的规范化研究奠定了基础。这些研究成果对实施中医药标准化战略，加快构建中医药标准体系，提高中医药科技竞争力，促进中医药资源发挥更大社会经济效益具有重要意义，具有良好的推广应用前景，在做好研究工作的同时，推广研究产出的各项方法和技术，使得研究成果与中医药标准化实践紧密结合起来，充分发挥科研对实践工作的指导作用，真正实现科研与实际工作的相互促进。