利福平耐药实时荧光定量核酸扩增技术在结核病诊断中的研究进展

梁 愈，吴桂辉，黄 涛，章晓红，陈 红，Δ

(1.遵义医学院，贵州 遵义 563000；2.成都市公共卫生临床医疗中心，四川 成都 610061；3.四川省医学科学院·四川省人民医院，四川 成都 610072)

结核病(tuberculosis，TB)是感染结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis，MTB)而引起的一种慢性传染病，WHO最新工作报告显示[1]，2016年全世界约1040万人患病，170万人死亡，60万新病例对利福平(rifampicin，RIF)耐药，TB依然是全球公共卫生的重大威胁。目前TB诊断方法主要包括涂片法、结核培养及药敏实验(DST)等，涂片法简便、快速，但灵敏度低；结核培养灵敏度和特异度较高，且可对阳性菌株进行DST，但耗时长，易延误诊治。基于传统方法的局限性，新的诊断技术Xpert MTB/RIF检测应运而生，该技术由美国Cepheid公司研发的以核酸扩增为基础的全自动分子诊断方法，全程只需约2小时，即可检测MTB和RIF耐药，被广泛认为是TB诊断的突破口。下面将对该技术在肺结核(PTB)、肺外结核(EPTB)、儿童TB、HIV/MTB双重感染及耐多药结核(MDR-TB)中的应用做一综述。

1 Xpert MTB/RIF在PTB患者中的应用

TB可累及全身多个脏器，以PTB最为常见，占各器官TB总数的80%～90%，是最主要的TB类型。Xpert MTB/RIF作为PTB的一线快速诊断试验，其诊断价值得到了国内外广泛认可，Steingart等[2]报道，Xpert MTB/RIF作为替代涂片的初步测试，汇总灵敏度为89%，汇总特异度为99%；作为涂阴后的附加测试，汇总灵敏度为67%，汇总特异度为99%；对于涂阳、培阳的标本，汇总灵敏度为98%。最新meta分析中报道[3]，与结核培养相比，Xpert MTB/RIF灵敏度为87%，特异度为97%，在涂阳中，灵敏度为99%；涂阴中灵敏度为70%，与Steingart等[2]报道相近。Xpert检测在培养阳性中灵敏度高，但仍不到100%，因为培养阳性仅代表分枝杆菌培养阳性，不能区分MTB和非结核分枝杆菌(NTM)，而Xpert MTB/RIF能检测出结核分枝杆菌复合群，能有效的鉴定MTB和NTM。不管是国外还是国内研究中都报道了Xpert MTB/RIF在PTB诊断中的高敏感性和特异性，证实了其诊断价值，并推荐在结核病的初步检测中应用。

1.1痰标本的XpertMTB/RIF检测痰液为最常使用的呼吸道标本，其Xpert MTB/RIF试验在世界范围内各研究机构开展较为广泛，Chikaonda等[4]报道的痰标本行Xpert MTB/RIF检测的灵敏度为93.8%，特异度为97.4%，阳性预测值(PPV)为97.8%和阴性预测值(NPV)92.6%。一项大样本研究显示[5]，Xpert MTB/RIF检测培养阳性PTB的总体灵敏度为95.7%，特异度为99.3%；涂阳、培阳组中灵敏度为99.2%；在检测不同的痰液标本时，该试验的灵敏度和特异度有差异，使用咳出痰作为检测标本时，其灵敏度和特异度均较诱导痰高。另有报道Xpert MTB/RIF与涂片法和培养法对PTB检测的一致性良好，Kappa值分别为0.783和0.818[6]。目前痰的Xpert检测的报道较其他标本多，其高灵敏度和特异度得到有力证实，同时其与痰结核培养的一致性高，可推荐作为临床使用。

1.2支气管肺泡灌洗液(BALF)标本的XpertMTB/RIF检测有学者认为在我国BALF为更可靠的呼吸道标本，BALF的Xpert MTB/RIF试验可以在检测早期PTB时提供准确结果，尤其在反复痰涂片阴性和自主排痰困难、无痰或痰少患者中更有应用价值。Gowda等[7]的最新研究中证实，在痰涂阴性和痰少患者中，BALF行Xpert检测在PTB的诊断中具有较好的灵敏度，同时在培养阴性中亦有较好的诊断价值。在我国有关BALF的Xpert MTB/RIF试验准确性的报道相对较少，一回顾性研究中提到[8]，以结核培养作为标准，Xpert MTB/RIF的灵敏度为84.5%，特异度98.9%；以临床诊断作为标准，Xpert MTB/RIF试验的灵敏度和特异度分别为72.9%和98.7%，显著高于涂片法。另一双中心前瞻性研究也肯定了BALF的Xpert检测在中国成人PTB诊断中的价值，研究中报道，以结核培养为标准，Xpert检测PTB的灵敏度为83.1%，特异度为84.1%，灵敏度与Lu等[8]研究相近，特异度有差异[9]。韩丹等[10]通过比较BALF抗酸涂片、结核培养和 Xpert试验三种检测方法，其曲线下面积(AUC)分别为 0.551、0.674、0.810，显示Xpert MTB/RIF检测诊断效能最大；同时对Xpert MTB/RIF和结核培养进行Kappa检验，Kappa值为0.55，显示两种检测方法一致性较好。

1.3非呼吸道标本的XpertMTB/RIF检测研究证实，多种非呼吸道标本的Xpert MTB/RIF试验对TB的诊断有较好准确性。Sulis等[11]的研究中提到，在非呼吸道样本中，Xpert MTB/RIF检测的灵敏度、特异度、PPV和NPV分别为78.3%、91.5%、81.8%和89.6%。Kokuto等[12]关于粪便Xpert MTB/RIF检测诊断PTB的报道中，在痰涂片阳性(1+至3+)患者中，粪便Xpert MTB/RIF的灵敏度为100%，痰涂片弱阳性(±)患者中灵敏度为是81.0%，痰涂片阴性(-)患者中的灵敏度是50.0%；非TB组的所有粪便样本Xpert MTB/RIF检测均为阴性，诊断特异度为100%。在涂阴PTB的研究中，胃灌洗液(GLA)行MGIT检测和Xpert的灵敏度分别为12.1%和48.6%，与国内的研究一致，均肯定了GLA标本的高阳性率[13，27]。

2 Xpert MTB/RIF在EPTB患者中的应用

EPTB是指结核病变发生在肺以外的器官和部位，约占所有TB的15%，有meta分析中提到，XpertMTB/RIF在诊断EPTB的灵敏度和特异度分别为77%和97%[14]。国内研究报道[3]，以结核培养为标准，Xpert用于诊断EPTB的灵敏度为80%，特异度为97%，AUC为97%。国外文献报道，以培养作为金标准，Xpert诊断EPTB的灵敏度为0.763，特异度为0.987[15]，与国内报道相近。Xpert MTB/RIF在EPTB的诊断中灵敏度及特异度较诊断PTB低，可能因为Xpert MTB/RIF检测的准确性与标本类型及标本内MTB的浓度有关，而EPTB的标本取材困难、标本异质性大、含菌量少等，所以导致该检测在EPTB的诊断效能低于在PTB中的诊断效能。

2.1结核性胸膜炎(TP) TP为最常见的EPTB之一，目前TP的诊断主要依赖在胸腔积液或胸膜中通过培养检测MTB，或通过组织病理学检查来证明胸膜中的干酪性肉芽肿。据研究报道，以结核培养作为标准，Xpert MTB/RIF的总体灵敏度为59%和特异度为92%，在不同的标本中其灵敏度存在差异，液体标本的灵敏度为51%，其中胸水为仅为47%[16]。国外Meta分析中提到[14]，胸水Xpert检测的汇总灵敏度较低(37%)；国内最新的meta分析中也报道，胸水Xpert检测的汇总灵敏度和特异度分别为30%和99%[17]。综合目前国内外研究，胸腔积液Xpert MTB/RIF试验灵敏度较低，作为TP的筛选测试价值有限。胸膜活检为更可靠的诊断TP的方法，有报道涂片阴性的TP患者胸膜活检样本行Xpert MTB/RIF试验的灵敏度和特异度分别为85.5%、97.2%[18]，均较胸腔积液样本高，可弥补液体样本的不足，更能准确诊断TP。

2.2结核性脑膜炎(TBM) TBM是最严重的TB类型，诊断困难，易延误诊治。以临床诊断TBM为标准，脑脊液(CSF)的Xpert检测的灵敏度为59.3%，特异度为99.5%，而CSF涂片和培养的灵敏度分别为78.6% 和66.5%，均较Xpert法高[19]。有报道离心CSF样本Xpert检测的灵敏度显著高于未离心样本，与培养的灵敏度相近，离心CSF优化了Xpert试验在TBM检测中的性能[20]。除外常用的CSF检查，组织病检亦是诊断TBM的途径，对于组织病理学确诊的TBM，Xpert检测的灵敏度为100%，特异度为87%，对于组织病理学高度怀疑TBM的病例，其灵敏度为是87%[21]。Xpert检测对于TBM的诊断能力有限，应综合临床各指标进行综合评估及诊断，避免延误诊治。

2.3其他EPTB最新meta分析中提到[22]，Xpert MTB/RIF检测在肌肉骨骼TB的诊断中，汇总灵敏度和特异度分别为81.0%和83.0%，AUC超过0.9，表明Xpert用于检测肌肉骨骼TB总体诊断准确度相对较高。在脊柱TB的应用中，抗酸染色、BACTEC MGIT960液体培养及Xpert检测的灵敏度分别为25.92%、48.15%、77.78%，Xpert的灵敏度显著高于传统方法[23]。Xpert检测在结核性腹膜炎中应用的报道相对较少，Edwards等[24]的报道中肯定了Xpert在结核性腹膜炎诊断中的价值，推荐在腹膜透析患者中早期筛查，避免延误诊断。

3 Xpert MTB/RIF在儿童TB中的应用

Xpert MTB/RIF检测在成人的应用价值得到了较多的肯定，因儿童TB的特殊性(不典型的临床症状、排痰取痰困难、标本含菌量少、不配合肺外标本获取等)，其在儿童PTB和EPTB方面的应用受限。痰液Xpert MTB/RIF检测诊断儿童PTB的汇总灵敏度为62%，汇总特异度为98%[25]。有相关文献报道使用BALF和GLA这两种标本分别行涂片、培养和Xpert检测，均显示Xpert的灵敏度显著高于另外两种方法[26]。Lu等[27]的报道中提到，收集确诊TB的儿童的痰液、GLA、BALF和CSF等样本，Xpert的检出率显著高于固体培养，且不同样本类型的Xpert阳性率显著不同，GLA的阳性率最高。在合并HIV感染的儿童TB中，痰/胃抽吸物Xpert的灵敏度为60%，特异性为98%，粪便Xpert的灵敏度为63%，特异度为99%[28]。由于儿童自主排痰困难，且痰标本容易污染，合格率低，而GLA、BALF等非痰液标本的阳性率相对较高，因此临床上可通过非痰标本的Xpert检测提高儿童TB的检出率。

4 Xpert MTB/RIF在HIV/MTB双重感染患者中的应用

TB是HIV患者最易感染的疾病之一，也是最主要的致死原因，成人HIV患者中约16.9%合并MTB感染[29]，据WHO报告，2016年，艾滋病病毒阳性者中有37.4万人死于PTB，全球TB中约10%为艾滋病病毒感染者[1]。因此，在HIV/MTB双重感染的患者中，早期的明确MTB诊断，及时的抗MTB治疗，有助于降低HIV患者的死亡风险。Steingart等[2]报道，对于HIV感染者，Xpert MTB/ RIF汇总灵敏度为79%，对于没有感染艾滋病毒的患者，汇总灵敏度为86%。另外，Xpert的灵敏度与患者免疫缺陷状态相关，有报道中提到，免疫缺陷严重组(CD4+<100 cells/mm3)中Xpert的灵敏度为82.9%，免疫缺陷轻症组(CD4+>200 cells/mm3)中其灵敏度为46.7%，严重组显著高于轻症组[29]。国内研究报道，在HIV阳性的患者中，Xpert MTB/RIF检测的灵敏度为81%，特异度为98%[3]，特异度均较高，灵敏度与国外研究有差异，可在国内进一步展开该研究，更准确了解我国HIV/TB双重感染现状及Xpert检测在该类患者中的诊断价值。由于HIV/TB 患者的痰标本常不易获取，临床中常使用尿液样本行Xpert检测，有研究比较了痰样本、尿样本、痰和尿样本联合使用行Xpert检测，三组的灵敏度分别为28.1%、64.0%和77.7%[30]，可见在HIV/TB双重感染患者中，采用多种标本联合行Xpert检测可有助于提高试验的准确性，从而准确检出结核。

5 Xpert MTB/RIF在MDR-TB患者中的应用

MDR-TB指致病MTB至少同时耐异烟肼 (INH) 和RIF。据WHO报告，2016年约49万患有MDR-TB，约4.1%的新发病例和19%的接受过抗结核治疗的病例患有MDR-TB[1]。早期检测出机体对抗结核药物的耐药情况，有针对性的选择抗结核药物，避免无效的抗结核治疗。目前检测MDR-TB常用的DST为BACTEC MGIT960，有相关文献均提到，在检测MTB及耐药性方面，BACTEC MGIT960法与传统的罗式培养药敏高度一致，用时需1周至半月左右，可替代传统培养及药敏检测[31]，而Xpert MTB/RIF检测与BACTEC MGIT960法在检测RIF耐药方面一致性较高，用时仅需2小时。Xpert检测在MDR-TB诊断的总体灵敏度、特异度、PPV和NPV分别为98.6%、100%、100%和93.8%[32]，因其高灵敏度使得其可与常规DST媲美。但实际应用中发现Xpert与BACTEC MGIT960法在检测RIF耐药性方面仍存在一定差异，因Xpert对rpo-B基因哑变异的菌株可能出现假阳性，而哑变异的基因并不会改变其相应蛋白质的表达，因此可能造成Xpert法与常规DST结果不一致，可能与MTB存活状态、标本含菌量、患者的用药史等有关。最新的meta分析报道，Xpert在检测耐药性方面，新发耐RIF的病例中有33.3%表现出对INH敏感，而之前已接受抗结核治疗的耐RIF病例中有14.8%对INH敏感[33]，可见在检测RIF耐药的基础上，Xpert检测并不能完全准确反映INH耐药情况。因此，临床上对于Xpert MTB/RIF检测出RIF耐药的病例，可再行常规的DST进一步明确。总体来说，Xpert MTB/RIF检测灵敏度高，用时少，在MDR-TB的诊断上具有足够的优势，可指导临床快速识别MDR-TB，从而尽早选择更合理的抗结核治疗方案，提高MDR-TB患者的治疗疗效，降低死亡率。

6 总结与展望

Xpert MTB / RIF是一种快速准确检测MTB及RIF耐药的方法，尤其在PTB、HIV/MTB及MDR-TB患者中的诊断价值较高，但在EPTB及儿童TB应用中有其局限性，可通过不同标本的联合送检提高其检测的准确度。总之，该方法可快速帮助临床医生做出临床决策，应用价值较高，值得临床推广。