槟榔内生真菌的分离与鉴定

易天凤 吴友根 于靖 张军锋 杨东梅 姚广龙 卓小垒

【摘 要】 目的：對槟榔根、叶和果的内生真菌进行分离及鉴定，并对其多样性分析。方法：采用平板分离法分离内生真菌，采用ITS序列分析鉴定内生真菌菌属。结果：从槟榔的根、叶和果中分离获得53株内生真菌，并鉴定为9个属，分别为曲霉属Aspergillus、刺盘孢属Colletotrichum、镰刀菌属Fusarium、毛双孢属Lasiodiplodia、Meyerozyma sp.、青霉属Penicillium、拟茎点霉属Phomopsis、Pleosporales sp.、木霉属Trichoderma;其中优势菌属为木霉属Trichoderma;叶部内生真菌多样性指数（1.11）要高于根（0.87）和果（0.87）;叶（0.57）比根（0.41）和果（0.41）的均匀度高;且槟榔根与叶、根与果、果与叶之间的内生真菌相似程度较高。结论：槟榔内生真菌的多样性将为槟榔内生真菌代谢产物活性研究及新化合物的开发和挖掘，进而充分发挥其药用价值。

【关键词】 槟榔;内生真菌;木霉属

【中图分类号】R285.5 【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2019）23-0022-06

Isolation and Identification of Endophytic Fungi from Areca catechu L.

YI Tianfeng WU Yougen* YU Jing ZHANG Junfeng YANG Dongmei YAO guanglong ZHUO Xiaolei

College of Horticulture， Hainan University， Haikou 570228， China

Abstract：Objective To isolate and identify endophytic fungi from the roots， leaves and fruits of Areca catechu L .， and analyze its diversity. Methods Endophytic fungi were isolated by plate separation method， and endophytic fungi were identified by ITS sequence analysis. Results 53 endophytic fungi were isolated from the roots， leaves and fruits of betel nut， which belonged to 9 genus of Aspergillus， Colletotrichum， Fusarium， Lasiodiplodia， Meyerozyma sp.， Penicillium， Phomopsis， Pleosporales sp.， Trichoderma. The dominant genus is Trichoderma. The endophytic fungi diversity index （1.11） is higher than root （0.87） and fruit （0.87）.The uniformity of leaf （0.57） radix （0.41） and fruit （0.41） High， and endophytic fungi between roots and leaves， roots and fruits， fruits and leaves have higher level of similarity. Conclusion The diversity of endophytic fungi in Areca catechu L . will for the study of endophytic fungal metabolite activity and the development and excavation of new compounds， so as to give full play to its medicinal value.

Keywords：Areca catechu L .， Endophytic fungus， Trichoderma

槟榔（Areca catechu L .）为棕榈科槟榔属常绿乔木，原产于东南亚，目前主要种植于我国的海南省，产量已经占总产量的90%以上，是海南省除橡胶产业之外的第二大支柱产业[1-2]。经国家批准，槟榔在海南省已经被列入生态经济林树种。槟榔还具有重要的药用价值，位居中国四大南药之首，其果实、种子、皮、花均可入药。

植物内生真菌是指那些能在健康植物的不同组织或者细胞内生存，对植物组织不会引起病害症状的真菌[3]。一些内生真菌可形成与宿主植物具有明显区别的代谢系统，进而产生具有很多丰富作用的次生代谢产物[4]。而药用植物的内生真菌的研究是从1993年开始，由于能從短叶紫杉的树皮中分离出紫杉醇，这给寻找功能性植物内生真菌提供了一个可靠的依据。种类丰富的内生真菌，产生结构多种多样，作用十分丰富的次生代谢产物，这给今后其他植物的病虫害防治提供一个新的思路[5-7]。由于内生真菌与宿主之间的联系与作用，使得在植物中内生真菌的研究具有十分重要的优势。利用现代的技术手段，提高目标化合物的产量，避免了资源浪费，同时还可以保护环境[8]。因此，在人们探索生物活性物质资源时，内生真菌具有其独特优势。

目前，有关槟榔内生真菌分离鉴定及其次生代谢产物相关的研究报道很少。宋薇薇等[9]从槟榔根、叶、花中分离纯化得到47株内生真菌，鉴定属于8个属。很多研究报告发现木霉属真菌可产生一些生物碱以及其他活性物质，可见，研究槟榔内生真菌对新活性物质的收集有良好的前景。本研究以槟榔根，叶，果为研究对象，根据ITS序列分析鉴定组织内生真菌，为进一步开展槟榔内生真菌资源收集与药用价值开发。

1 材料与方法

1.1 实验材料 本研究的植物材料采自2018年9月份万宁市山根镇（N18°58′8.52″， E110°28′56.28″）和万宁市北大镇（N18°91′8.50″， E110°29′64.30″）健康的槟榔树（Areca catechu L .）。主要试剂：PDA固体培养基;马铃薯葡萄糖肉汤（PDB）液体培养基;8 %次氯酸钠溶液;75 %酒精;真菌基因组DNA提取试剂盒（北京索莱宝Solarbio科技有限公司）;测序引物序列为ITS4：5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3;ITS1F：5-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3（由天一辉远生物科技有限公司合成）。

1.2 槟榔内生真菌分离 采取健康新鲜的槟榔根、叶、果，用超纯水冲洗干净后使用2.6%次氯酸钠和75%乙醇浸泡，浸泡时间设置5个梯度25个组合（次氯酸钠设置时间梯度： 30s、45s、60s、75s、90s; 乙醇设置时间梯度： 30s、60s、90s、120s、150s），再用无菌水冲洗3～5次。根用消毒手术刀切去头尾，再把中间部位切成0.5～1cm长的小段;用消毒手术刀将叶边缘部分去除，切分成0.5cm×0.5cm大小的组织块;用消毒手术刀将果纵切后横切为0.5cm×0.5cm。将配好的PDA培养基进行灭菌，灭菌均采用LDZX-50KBS高温高压灭菌锅（生产于上海申安有限公司），灭菌条件为121℃、20min。把各组织块分别放在灭菌的PDA固体培养基平板上，2min后取出放入另外干净PDA固体培养基平板上，再将最后一次清洗组织块的无菌水用移液枪吸取少量滴入PDA培养基中，并在实验过程中放入空白对照，于温度25℃恒温箱中培养5d左右，多次纯化后试管保存。

1.3 测序鉴定 从保存的试管中刮取菌丝体接种到马铃薯葡萄糖肉汤（PDB）液体培养基中，放入50rpm/min恒温摇床在25℃、黑暗条件下进行培养，参照真菌基因组DNA提取试剂盒的使用方法提取槟榔内生真菌DNA，再进行PCR反应（反应体系设置为25μL，反应条件为94℃ 5min; 94℃ 40s，55℃ 40s， 72℃ 55s， 35个循环;72℃ 10min， 4℃ ∞）。采用AGT9601PCR扩增仪（生产于杭州安杰思医学科技有限公司）进行扩增，PCR扩增产物送往铂尚生物技术（上海）有限公司进行测序。

1.4 数据处理 用Excel 2016软件处理数据，NCBI网站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）进行序列比对，MEGA5.2软件建立系统发育树。

2 结果与分析

2.1 槟榔内生真菌分离及DNA扩增 通过平板分离法对槟榔内生真菌进行分离纯化，表面消毒检测情况显示对照组无明显菌落长出，表明试验材料表面已消毒彻底，分离获得的菌株来自槟榔组织内部。将分离得到的槟榔内生真菌进行DNA提取及rDNA-ITS序列PCR扩增，1.0 %琼脂糖凝胶电泳显示，扩增序列条带在600bp左右。如图1所示。

2.2 槟榔内生真菌鉴定 经过测序鉴定获得了53株槟榔内生真菌，从根、叶和果中分离获得到的内生真菌分别占14株、25株和14株（表1、表2）。通过BLAST比对初步鉴定为9个属，分别为曲霉属Aspergillus、刺盘孢属Colletotrichum、镰刀菌属Fusarium、毛双孢属Lasiodiplodia、Meyerozyma sp.、青霉属Penicillium、拟茎点霉属Phomopsis、Pleosporales sp.、木霉属Trichoderma。基于ITS序列分析将G9-1-2、F20、G14、Y27、F13、F28、G21建立系统发育树（图2），各菌株与其相似菌株的支持度可达100 %。木霉属Trichoderma在槟榔内生真菌中为优势菌属，菌株比例达到了26.42% （表2）;叶部优势菌属也为木霉属;而根部的优势菌属为曲霉属Aspergillus。

2.3 槟榔内生真菌多样性分析 根据Shannon-Wiener 多样性指数（H′），槟榔根、叶和果的H′值分别为0.86、1.11和 0.86，其中叶部内生真菌的多样性最高;叶（0.57）比根（0.41）和果（0.41）的E值高，表明叶部内生真菌较为丰富且分布均匀。从根、叶和果3个部位的内生真菌种类的相似性指数来看，Cs都在0.8以上，说明各部位之间的真菌种类极为相似（表3）。从槟榔根、叶、果中分离得到的53株内生真菌中曲霉属Aspergillus、刺盘孢属Colletotrichum、Meyerozyma sp.、青霉属Penicillium、木霉属Trichoderma在三个部位都存在;而镰刀菌属Fusarium只在叶和果中获得，毛双孢属Lasiodiplodia只分布于根和果中，拟茎点霉属Phomopsis只在根与叶中存在，Pleosporales sp.则在分离于根和果，说明同一菌属在不同部位分布存在差异（表2）。

3 讨论

自20世纪70年代，内生真菌被广泛研究，尤其在经济林木及药用植物，包括一些藻类、蕨类都发现了内生真菌[10]。而且在同一种植物中可分离出数十种内生真菌，多则上百种，尤其从热带雨林植物中分离获得的内生真菌多样性突出。本实验在槟榔不同根、叶、果中分离鉴定了53株内生真菌，鉴定为9个属，其中优势菌属为木霉属Trichoderma，且槟榔各组织的内生真菌分布也有差异，其叶部内生真菌分布较为丰富;而一些菌属存在于特定组织，例如毛双孢属Lasiodiplodia只分布于根和果中。大量的研究也表明，内生真菌存在于植物组织内，不仅表现了普遍性，而且表现出多样性。本试验中根、叶和果3个部位的内生真菌种类的相似性指数Cs都在0.8以上，说明各部位之间的真菌种类极为相似。而大多数植物内生菌分布于植物不同的组织和器官内，并且宿主植物和内生真菌的种属往往决定了它们的分布情况[11-12]。本实验在槟榔不同部位分离的内生真菌种属存在差异，这样的实验结果可能表明槟榔不同组织结构以及不同的营养条件而导致植物体内微环境有差异[13]。木霉属从槟榔中分离的比例较高，达到了26.42%，且该属主要分布于叶部说明该属内生真菌表现出不同的器官或组织偏好性[14]。这与宋薇薇[9]的研究结果有差异，宋薇薇从槟榔根、叶和花中分离获得的青霉属（31.91%）和镰刀菌属（27.66%）为优势菌属，这可能由于种植环境条件及分离部位的差异造成[15]。

目前，很多学者对药用植物的内生真菌进行深入探索，大量研究表明植物内生真菌能产生和宿主植物相同、类似或结构新颖的次级代谢产物，目前在药用研究及应用上有很大的前景。张杰[16]从蛇足石杉茎中分离得到1株产生物碱的内生真菌菌株LYS081，初步鉴定也为木霉属（Trichoderma）。槟榔中槟榔生物碱是主要活性物质，而槟榔生物碱有改善胃肠功能，治疗糖尿病，促进神经兴奋，预防癌症和保护血管等作用[17]。这为有效挖掘槟榔药用价值提供了重要线索。因此，本研究对槟榔内生真菌的分离鉴定将为槟榔内生真菌代谢产物活性研究及新化合物的开发和挖掘提供了前提条件。

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（收稿日期：2019-09-24 編辑：刘 斌）

基金项目：海南省自然科学基金项目（201608364）。

作者简介：易天凤（1993-），女，汉族，硕士，研究方向为药用植物资源开发与应用。E-mail：ytf9316@163.com

通信作者：吴友根（1975-），男，汉族，博士，教授，博士生导师，研究方向为南药植物资源开发与利用。E-mail： wygeng2003@163.com