辽细辛精油对瓜类果斑病菌的抑菌效果

刘南南 袁凤英 王桂清

摘要：为明确辽细辛精油对植物病害致病细菌的作用效果，以瓜类果斑病菌为靶标菌，以链霉素等化学农药为阳性对照，采用浑浊度法和抑菌圈法研究辽细辛精油抑菌活性。结果表明，辽细辛精油对瓜类果斑病菌具有一定的抑菌效果，但效果不理想，仅当浓度≥2 000 mg/L时表现为抑制作用，否则表现出促进作用;辽细辛精油对瓜类果斑病菌的作用效果不及链霉素和氢氧化铜等化学农药，但与叶枯唑等个别农药的效果相当，且作用趋势一致。

关键词：辽细辛精油;瓜类果斑病;浑浊度法;纸片法;打孔法

中图分类号：S792.26; Q934.1    文献标识码：A    文章编号：1674-1161（2019）06-0010-04

瓜类果斑病又称细菌性果腐病，是瓜类生产上的重大毁灭性病害之一，在国内局部地区发生，被列入官方控制之下，要求实施检疫并加强防治。但目前，我国的细菌性病害的防治技术落后于真菌病害。植物精油来自于天然，环境兼容性好，且无论是以单种植物精油还是以多种植物精油混合物作为制剂，都具有良好的抑菌活性。辽细辛（Asarum heterotropoides Fr.Schmidt var.mandshuricum（Maxim）Kitag）为马兜铃科细辛属植物，是地道中草药，其活性成分主要为精油，对植物病害致病真菌具有良好的抑菌效果。以瓜类果斑病菌为靶标菌，以链霉素等化学农药和辛夷精油为阳性对照，采用浑浊度法和抑菌圈法研究辽细辛精油作用效果，旨在确定辽细辛精油对植物病害致病细菌的作用效果，为开发新型抑/杀细菌植物源农药奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试菌种及培养

瓜类果斑病菌（Acidovorax avenae subsp.citrulli）由聊城大学植物病理研究室提供，采用平板划线分离培养法培养。培养基为牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（BPA），即牛肉浸膏3 g、蛋白胨10 g、氯化钠5 g、琼脂20 g、蒸馏水1 000 mL。

1.2 供试制剂及配制

辽细辛精油采用超临界CO2法萃取，辛夷精油采用蒸馏法提取，均由聊城大学农学院植物病理研究室提供。两者均用微量二甲基亚砜溶解后，用无菌水配制成4 000 mg/L的母液。

72%农用硫酸链霉素可溶性粉剂（成都普惠生物工程有限公司），用无菌水溶解后制成400 mg/L母液;77%氢氧化铜可湿性粉剂（浙江瑞利生物科技有限公司），用无菌水溶解后制成2 000 mg/L母液;20%叶枯唑可湿性粉剂（浙江瑞利生物科技有限公司），用无菌水溶解后制成4 000 mg/L母液。

供试制剂母液用无菌水按表1配制成所需浓度。

1.3 活性测定方法

1.3.1 浑浊度法 制备含药BPA培养基，将培养好的瓜类果斑病菌用生理盐水悬浮至0.5个麦氏比浊度，向各處理培养基中分别接种100 μL菌液，以只含溶剂的处理做空白对照，在37 ℃和120 rpm条件下震荡培养。培养前采用比色法，在600 nm波长下分别测定各处理的OD值，待对照处理达到对数生长期时，再测定各处理的OD值。OD值越小，抑菌效果越好。细菌生长抑制率计算方法为：

P=（A0-A1）/A0

式中：P为生长抑制率，%;A0为空白对照的OD值增加值;A1为药剂处理的OD值增加值。

1.3.2 纸片抑菌圈法 选取吸水性强、质地均匀的定性滤纸，打直径6 mm的圆型纸片，120 ℃下干热灭菌2 h，按每100片纸片加入药液0.5 mL的比例浸透，干燥后分装。

将于BPA培养基上在37±1 ℃恒温培养箱培养48 h的瓜类果斑病菌，用生理盐水制备成细菌悬浮液。用无菌棉拭子蘸取菌液，涂布于培养基表面，确保涂布均匀。待培养基水分被琼脂吸收后，放置含药圆纸片，每皿5张，间距不少于24 mm，纸片中心距平皿边缘不少于15 mm。37±1 ℃恒温培养48 h后取出，测量抑菌圈直径，根据表2判断结果。

1.3.3 打孔抑菌圈法 无菌条件下制作BPA培养基平板，凝固后，用外径6 mm的打孔器在中央打孔1个，四周等距离打孔5个;在每孔中滴加少量0.5%琼脂封底后，四周孔中加入不同浓度的供试制剂0.05 mL，中间孔加入同体积无菌水作为对照。于37±1 ℃恒温培养48 h后，测量抑菌环直径大小，判断药物的抑菌效果。

1.4 数据处理

试验数据处理由Excel完成，毒力分析由DPSv13.0专业版完成。

2 结果与分析

2.1 浊度法对瓜类果斑病菌的抑菌效果

采用浑浊度法测定不同制剂对瓜类果斑病菌的抑菌效果，结果见图1和表3。

由图1可知：链霉素对瓜类果斑病菌的抑菌效果最好，抑菌率61.09%～99.18%，EC50和EC90分别为19.172 mg/L和118.62 mg/L;其次为氢氧化铜，在其用药量为链霉素5倍的情况下，抑菌率也不及链霉素，EC50和EC90分别为994.04 mg/L和2849.9 mg/L，即其抑菌50%的效果为链霉素的51.85倍，抑菌90%的效果为链霉素的24.03倍。

由表3可知：遼细辛精油和叶枯唑的用药量相同，两者的活性趋势一致，即高浓度下抑制，低浓度下促进;两者的抑菌效果也一致，当浓度≥2 000 mg/L时，对瓜类果斑病菌表现出一定的抑制作用，抑制率为7.51%～22.7%，当浓度≤1 000 mg/L，表现为促进作用，促进率13.56%～56.88%，说明辽细辛精油和叶枯唑对瓜类果斑病菌的作用效果一致。

辛夷精油的供试浓度与辽细辛精油完全一致，其对瓜类果斑病菌表现为促进作用，促进率88.05%～288.02%，明显高于辽细辛精油。

2.2 纸片法对瓜类果斑病菌的抑菌效果

纸片法的抑菌圈试验结果见图2—3和表4。

由试验结果可知：链霉素对瓜类果斑病菌的抑菌效果最好，浓度为400 mg/L时抑菌圈直径为23 mm，表现为极敏;氢氧化铜次之，浓度为2 000 mg/L时抑菌圈直径为20.97 mm，表现为极敏，浓度为500～1000 mg/L时表现为高敏，浓度为125～250 mg/L时表现为低敏，但其用药量为链霉素的5倍;辽细辛精油和叶枯唑在浓度为4 000 mg/L时均产生明显的抑菌圈，直径分别为2.2 mm和15.07 mm，辽细辛精油表现为低敏感性，叶枯唑表现为高敏感性，且两者的抑菌趋势相同，抑菌圈直径均随药剂浓度降低而减小，敏感性降低;辛夷精油在供试浓度下没有抑菌圈，即对瓜类果斑病菌无抑菌效果。

2.3 打孔法对瓜类果斑病菌的抑菌效果

打孔法的试验结果见图4—5和表5。

由图4和图5可以看出，采用打孔法测定的不同制剂对瓜类果斑病菌的抑菌效果与纸片法一致，且各制剂的抑菌活性趋势也相同，不同制剂供试浓度下的抑菌圈直径大小稍有变化，但变化不大。

比较浑浊度法和抑菌圈法，浑浊度法需要分光光度计测定OD值，操作复杂，效果也不及抑菌圈法直观;比较纸片法和打孔法，纸片法操作简单，抑菌圈明显，更适合细菌的抑菌效果试验。

3 结论与讨论

辽细辛精油对植物病害致病细菌具有一定的抑菌效果，但效果不理想。当其浓度较高时，对瓜类果斑病菌表现为抑制作用，如浓度为4 000 mg/L时的抑菌率为16.21%，抑菌圈直径为2.2 mm，浓度为2 000 mg/L时的抑菌率为9.44%，抑菌圈大小为1.03 mm;但当其浓度较低时，则无抑菌效果，甚至表现出促进作用，如浓度为250 mg/L时促进率为56.88%，无抑菌圈。

辽细辛精油对瓜类果斑病菌的作用效果与个别化学农药的作用趋势相同。研究中辽细辛精油的用药量是链霉素的10倍，是氢氧化铜的2倍，但其抑菌效果不及后两者，链霉素和氢氧化铜对瓜类果斑病菌表现出极高的抑制效果，EC50分别为19.172 mg/L和994.04 mg/L，而辽细辛精油在4 000 mg/L时的抑菌率仅为16.21%，说明其EC50将远远高于4 000 mg/L。辽细辛精油和叶枯唑的用药量相同，两者的活性趋势一致，即高浓度下抑制，低浓度下促进;两者的抑菌效果也很一致，当浓度≥2 000 mg/L时对瓜类果斑病菌表现出一定的抑制作用，但抑制率均低于22.7%，说明二者对瓜类果斑病菌的作用效果一致。

不同的植物精油对瓜类果斑病菌的作用效果不同，辽细辛精油在高浓度下具有一定的抑菌效果，而辛夷精油即使在高浓度下也无抑菌效果，反而表现为促生长作用。

当前，有关植物提取物对植物病原菌抗菌活性的研究较少，但植物是最好的化学合成杀菌剂替代品。许多植物精油具有多重生物活性，即具有杀虫活性，也具有抑菌活性，具有较大市场潜力和良好的发展前景。

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Bacteriostatic Effect of the Asarum Essential Oil on Acidovorax Citrulli

LIU Nannan， YUAN Fengying， WANG Guiqing*

（College of Agronomy， Liaocheng University， Liaocheng Shandong 252059， China）

Abstract： In order to clarify the effect of asarum essential oil on bacteria causing plant diseases， the bacteriostatic activity of asarum oil was studied by turbidity method and bacteriostatic zone method， with Acidovorax citrulli as the target bacteria and chemical pesticides such as streptomycin as the positive control.The results showed that： The Asarum essential oil has certain bacteriostatic effect on Acidovorax， however the effect is not ideal. It only shows inhibitory effect when the concentration is greater than or equal to 2 000 mg/L， otherwise it showed promoting effect; The effect of the Asarum essential oil on the Acidovorax was less than that of chemical pesticides such as streptomycin and cupric hydroxide， whereas the effect was similar to that of individual pesticides such as bacuzole， and the action trend was consistent.

Key words： Asarum essential oil; Acidovorax citrulli; turbidity method; paper method; punch method