类固醇激素在乳腺癌中的作用及对肿瘤干细胞的影响

王 宇 乔娟娟 张 磊 刘四卫 杨树才

类固醇激素尤其雌激素和孕激素在乳腺癌的发病、进展和治疗中起着重要作用。近年来，类固醇激素在乳腺干细胞稳态中作用的研究取得了重大进展。乳腺肿瘤干细胞(Breast cancer stem celles，BCSCs)是乳腺癌进展潜在的诱导因素，其干细胞表型是动态变化的，易受到细胞信号传导和外部环境的影响，尤其易受到雌孕激素的影响。孕激素已被确定是调节正常小鼠乳腺干细胞和正常人乳腺干细胞的关键激素。合成孕激素可能通过诱导干细胞的增殖增加乳腺癌发生的风险。孕激素可能通过转录因子、信号转导途径和microRNA的调节来增加乳腺癌细胞系中的BCSCs的数量。另有研究报道雌激素也可以调节BCSCs的数量，类固醇激素可能是控制BCSCs数量和功能的关键参与者。

1 BCSCs概述

BCSCs来源于人乳腺肿瘤，细胞表面有多种标志物，包括CD44、CD24、CD133、上皮细胞粘附分子(Epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)、巢蛋白、神经节苷脂GD2、CD49f、CD61、CXCR4、CXCL1、HMGCS、CD166、CD47、ALDH1和ABCG2[1]。其中CD44+/CD24-是BCSCs的分子量最小的表面标志物。CD44是一种跨膜糖蛋白，与许多细胞外基质蛋白结合。乳腺癌中CD44 mRNA和蛋白高表达与患者预后不良相关，在其他肿瘤细胞系中也可发现CD44的高表达[2]。因此，CD44被认为是肿瘤干细胞(Cancer stem cells，CSCs)的有效生物标志物[3]。同时，ALDH1的表达也被认为是乳腺中CSCs的特征性标志物，亦与乳腺癌不良预后相关。尽管乳腺癌的不同亚型之间存在差异，但与其他CSCs标志物相比，ALDH1阳性表达更加稳定[4]。目前，通过使用CD44+/CD24-和ALDH+可以实现BCSCs的最大程度的富集[5]。有研究证实，激素作为调节BCSCs活性的主要信号因子，可以通过影响肿瘤微环境而影响肿瘤的进展[4]。

2 雌激素及其受体在乳腺癌与BCSCs中的作用

2.1 雌激素及其受体与乳腺癌的关系

雌激素能够促进乳腺上皮细胞增殖，在乳房正常发育中发挥着至关重要的作用，另外雌激素可与乳腺肿瘤细胞上的雌激素受体(Estrogen receptor，ER)结合而刺激乳腺肿瘤细胞生长。雌激素可与ERα和ERβ结合，调节靶基因的转录[6]。生理形态的雌激素17β-雌二醇与ERα结合的亲和力高于ERβ，雌激素与乳腺上皮细胞上的ERα结合，而转录因子需要核受体共调节因子介导才能对靶DNA序列进行调控。在这种情况下，ER信号依赖于FOXA1表达，FOXA1能够促进局部DNA解旋，进而促进ER与DNA结合[7]。女性绝经后，体内雌激素过度暴露可增加乳腺癌的风险。但是用作激素替代疗法的外源性雌激素却可以降低绝经期女性罹患浸润性乳腺癌的风险，也降低了乳腺癌致死率[8]。雌激素在乳腺癌发生和发展中的矛盾的作用可能是雌激素对不同类型乳腺癌细胞的作用不同而导致的。雌激素可以促进ERα+的乳腺癌细胞增殖，而雌激素对ER-的BCSCs作用机制值得深入研究。

2.2 雌激素在BCSCs中作用的研究

尽管大量研究探讨了激素对BCSCs调节的作用，但雌激素在BCSCs中的作用机制仍不清楚。大多数研究认为，雌激素通过旁分泌机制刺激CSCs而发挥作用[9]。下调胚胎干细胞的基因后，用雌激素处理富含CSCs的乳球群能够降低ERα+乳腺癌细胞中BCSCs的比例。这一结果可以解释雌激素能够改善ERα+肿瘤患者预后的临床事实[10]。另有研究表明，ERα+乳腺癌细胞可以分泌FGFR和EGFR配体来结合雌激素，雌激素可以作为旁分泌介质促进CSCs活性并增加CD44+/CD24-/low细胞的比例[11]。也有少数研究提出雌激素本身不会改变肿瘤干/祖细胞特性[12]。

雌激素可以通过非基因组信号传导和ER突变体调节BCSCs。G蛋白偶联受体30(G protein-coupled receptor 30，GPR30)是一种七跨膜结构域受体，在ER+和ER-乳腺癌细胞和肿瘤中表达，GPR30能介导非基因组雌激素的信号传导。GPR30可以通过激活tafazzin(TAZ)来调节Hippo信号通路[13]。CD44+/CD24-细胞中存在TAZ的高表达，敲减细胞中的TAZ显著降低了CD44+/CD24-细胞群体和乳腺球形成能力[14]。另外，TAZ在原发性乳腺癌的CSC中过表达，与CSC介导的转移呈正相关，当TAZ被敲除后则显著降低了原发性乳腺癌的化疗耐药性和致瘤能力[15]。通过以上研究发现雌激素能通过GPR30激活TAZ从而增加CD44+/CD24-细胞的数量和致瘤能力。

尽管BCSC没有表达经典的ERα，但雌激素可以通过ERα36突变体和ERβ作用在BCSCs上。ERα36突变体通过AKT/GSK3β信号途径激活促有丝分裂信号，对维持ER+乳腺癌细胞的CD44+/CD24-BCSCs起到重要的作用[16]。ER-α36突变体缺乏配体依赖性和非依赖性反式激活结构域(ATF-1和-2)，而保留了与DNA结合、寡聚化和配体结合结构域[17]。在MCF-7和T47D细胞系中，ER-α36能够增强CD44+/CD24-细胞的自我更新能力从而增强他莫昔芬的药物抵抗。敲除ER-α36显著降低了CD44+/CD24-群体数量并阻断了他莫昔芬或氟维司群介导的CD44+/CD24-表型细胞的增加及乳腺球的形成[16，18]。在HER2+乳腺癌细胞系SKBR3中敲除ER-α36可降低HER2表达和ALDH+CSC群体的数量[19]。上述研究证实在ER+和HER2+ER-的肿瘤中，ER-α36突变体有调节BCSCs的作用。

研究发现ERβ表达与BCSCs标志物CD44和ALDH1密切相关，且三者对乳腺球形成至关重要[20]。另外在FACS分选的人乳腺干细胞中，亦发现ERβ基因明显上调[21]。尽管有上面诸多的研究基础，但是雌激素信号在BCSCs特征细胞上的作用机制仍不明确，尚需大量的实验研究加以丰富和证实。

2.3 抗雌激素药物和BCSCs

抗雌激素疗法常用于辅助和转移ER+乳腺癌的治疗。药物主要有选择性雌激素受体调节剂(Selective estrogen receptor modulators，SERMs，如他莫昔芬)和下调剂(Selective estrogen receptor downregulators，SERDs，如氟维司群)以及减少雌激素合成的芳香酶抑制剂[22]。由于BCSCs大多数为ER-，因此它们并不是抗雌激素疗法的靶点。上述治疗不但不能抑制BCSCs，还能使这些干细胞明显富集。来曲唑(芳香酶抑制剂)治疗后能刺激乳腺癌细胞CD44+/CD24-表型细胞的增加并伴有乳腺球的形成[23]。Piva研究团队也发现他莫昔芬耐药MCF-7细胞CD44+CD24-/low和ALDH阳性亚群增加并伴有乳腺球的形成，进一步研究发现其胚胎干细胞标志物SOX2的表达及随后WNT信号通路的激活是他莫昔芬治疗后BCSCs存活的关键[24]。

另有研究发现，ERα-36可通过增加CD44+/CD24-/low细胞和形成乳腺球能力来促进他莫昔芬抵抗[22]。在体外使用雌激素治疗后，患者衍生的乳腺癌细胞可以进行BCSCs(ALDH+细胞)富集，同时在体内使用源自患者的异种移植物也可以进行BCSCs的富集。ALDH+细胞中有JAG1配体和NOTCH4受体高表达，而高ALDH1表达与他莫昔芬治疗的抗雌激素抵抗相关[9]。最近，Sansone研究团队将癌症相关成纤维细胞中的miR-221或完整线粒体DNA转移至乳腺癌细胞内能够改变BCSCs(CD133+)的休眠状态，从而导致内分泌治疗抵抗[25]。

总之，这些发现证实抑制乳腺癌细胞中的雌激素信号传导可能导致BCSCs数目增加，同时在抗雌激素治疗后存活的BCSCs可以进入休眠状态并最终重新启动肿瘤生长。

3 孕激素及其受体在乳腺癌与BCSCs中的作用

3.1 孕激素及其受体与乳腺癌的关系

孕激素在妊娠期小鼠乳腺发育中起着关键作用。孕激素信号传导由孕激素受体(Progesterone receptor，PR)介导，包括PRA和PRB两种亚型。在正常乳腺上皮中，PR两种亚型的比例保持平衡，肿瘤微环境中这种平衡一旦被破坏，PRA的表达明显增高[26]。PRA则在卵巢稳态中起着重要作用，而乳腺形态主要与PRB有关[27]。小鼠模型实验证实，孕激素和PR信号传导通过扩大乳腺干细胞群来驱动乳腺发育[28]；这种信号传导也存在于致癌物诱导的乳腺肿瘤形成的过程中。孕激素刺激乳腺肿瘤细胞系中产生大量的祖细胞和BCSCs标志物[29]。

在乳腺扩张期间，PR通过旁分泌信号如RANKL(NF-κB配体的受体激活剂)和Wnt4介导乳腺上皮细胞的增殖。这些信号分子是PR+细胞分泌并作用到PR-祖细胞上，并表达RANK和Wnt受体Frizzled与LRP5/6等多种信号分子[28]。在多种啮齿动物模型中，PR或RANK/RANKL途径的缺失或抑制可显著减少乳腺癌的发生[30]。

使用雌激素/孕激素而非单独使用雌激素会增加浸润性乳腺癌的风险，这与之前认为孕激素是保护性激素的看法相冲突[31]。最初的研究认为，孕激素对绝经后正常乳腺的增殖刺激可增加罹患乳腺癌的风险[32]。然而，最近的研究证实孕激素可以增加并转化乳腺癌干细胞库，或激活隐匿性恶性干细胞，加速ER+和PR+乳腺肿瘤的发生[33]。

3.2 孕激素在BCSCs中作用的研究

孕酮和合成孕激素可增加ER+，PR+乳腺癌细胞系中BCSCs群体的数量，这一结果在富含PR的T47D异种移植肿瘤中首次得到证实。该肿瘤在给予单独的雌激素或雌激素加合成孕激素MPA的小鼠体内生长，孕激素治疗后，肿瘤中CK5+细胞数量明显增加，可高达总细胞的20%[34]。在导管型乳腺癌细胞系中，流式细胞术检测发现孕激素治疗后，总CD44+细胞群增加了8～12倍[35]。上述证据提出，在乳腺癌细胞系和细胞系种植的异种移植模型中，孕激素或其合成类似物增加了BCSCs群体的数量。

CXCR4/CXCL12是正常乳腺中孕激素诱导干/祖细胞功能的介质之一。孕激素的信号以旁分泌方式作用在表达CXCL12的管腔细胞上，而CXCR4在基底和PR-的腔细胞中表达。抑制CXCR4/CXCL12信号轴可以抑制孕激素诱导的乳腺干/祖细胞的增殖[36]。

另有研究证实，PR信号能够抑制miR-29和miR-141的表达，两者能分别解除对KLF4和STAT5A的抑制[37]，而KLF4是维持BCSCs和胚胎干细胞多能性所需的转录因子[38]，STAT5A是调节乳腺腔内祖细胞的转录因子[39]。解除了对KLF4和STAT5A的抑制后，乳腺癌细胞中CK5+/CD44+CSC群体的扩增、集落形成和体内成瘤能力明显增加。BCL6也是乳腺癌中孕激素诱导CK5+细胞必需的因子[40]，这种孕激素诱导的BCL6表达亦可被催乳素抑制，进一步证实了BCSCs调节与激素信号传导存在复杂的相互作用[41]。

综上，正常乳腺上皮细胞和BCSCs的增加在很大程度上是由孕激素诱导的，尽管其确切的机制尚不清楚，但是直接抑制PR或其旁分泌/下游介质可能成为乳腺癌预防和治疗的药物靶点。

3.3 抗孕激素药物和BCSCs

由于抗孕激素治疗药物缺乏活性或耐受性，目前在癌症治疗中并没有把抗孕激素治疗作为推荐的治疗方法[42]。最近的研究发现，使用抗孕激素药物如米非司酮和奥那司酮等可能靶向作用在ER+/PR+肿瘤中的BCSCs，虽然是假设，但值得进一步研究。在衍生的乳腺癌异种肿瘤模型中，发现孕激素调节剂具有抗肿瘤的潜力。醋酸乌利司他是一种选择性孕激素受体调节剂，亦具有显著的抗肿瘤作用，并可减少肿瘤中Ki67和Cyclin D1表达[43]。通过PR起作用的孕激素能够通过减少雌激素激活下游效应物的来改善雌激素的作用。这可能解释了为什么双阳性内分泌肿瘤(ER+/PR+)比单一ER+乳腺癌侵袭性弱，预后更好的原因[44]。PR作为潜在治疗靶点，因其可通过孕激素对ER共调节或通过PR信号传导减少祖细胞库，而具有较好的临床效益。尽管PR在乳腺癌BCSCs的作用研究有了一些新的进展，但还需要更多的实验来完善。

4 小结与展望

在乳腺癌中，雌激素和孕激素信号对BCSCs活性均有影响。因BCSCs内类固醇激素受体表达较低或为阴性，因此，激素效应是通过旁分泌或临近分泌细胞-细胞信号传导来介导的。调节BCSCs的激素的下游也存在一定程度的自分泌信号传导。在体外，雌激素治疗血清饥饿的乳腺癌细胞后，BCSCs活性明显上调，是受到EGF、FGF或Notch1受体的调节，亦可证实在这个过程中细胞间的间接、旁分泌或邻分泌信号起了重要的作用。相反，抗雌激素药物，如他莫昔芬或氟维司群，理论上应该可以阻断雌激素对细胞增殖的直接作用并对ER-BCSCs的间接信号的影响，但实际上他莫昔芬却增加了乳腺球菌集落培养中的BCSCs活性[13-14]。综上所述，雌孕激素与BCSCs的关系值得进行更深入的研究，为乳腺癌治疗提供更好的治疗靶点。