关节滑液检测在关节假体周围感染诊断中的研究进展*

邢赛 彭昊*

关节假体周围感染（periprosthetic joint infection，PJI）是关节置换术后可能出现的仅次于假体松动的第二大常见并发症[1]。研究发现，美国每年人工髋、膝关节置换术后发生感染的概率分别为2.0%、2.4%，而在欧洲分别为1.2%、0.8%[2-3]。关节置换术后发生感染，会造成关节疼痛肿胀，严重的会有窦道形成，脓液流出，继而引起关节假体松动，假体使用寿命大大缩短。而且感染后治疗非常复杂，目前处理原则是一期行关节旷置术，二期行关节翻修术。多次手术和长时间的治疗周期将成倍增加患者的痛苦和治疗费用。遗憾的是，目前对于PJI的诊断，还没有一种可以被普遍接受的可靠方法[4]。因为在临床实践中，临床病史和检查并不总是能够区分感染和无菌性松动，只有少数PJI病例具有典型的与关节相通的窦道。此外，血清标志物（如 C-反应蛋白、红细胞沉降率）在某些病例的诊断效率往往有限。再者由于大多数慢性PJI病例存在生物膜，且患者在采集培养标本前曾给予抗生素治疗，使得培养的假阴性率升高。

目前最被认可的PJI诊断标准是由美国骨肌系统感染协会在2011年制定的，该指南由两部分组成：2项主要标准：与假体相通的窦道形成；2个以上的假体周围组织标本培养出同一种病原菌。6项次要标准：ESR和CRP升高，关节液白细胞计数升高，关节液多形核细胞比例升高，存在脓液，1次细菌培养阳性，5个高倍镜视野中每一个的中性粒细胞数均大于5个。满足2项主要标准中的1项或者6项次要标准中的4项，就可做出诊断[5]。从中可以看出关节液指标占有很大的比重，首先穿刺细菌培养仍然是筛查特定微生物最有效的方法。然而，虽然从关节滑液和组织中可以培养出微生物，但是缺乏敏感性，而且培养结果是阴性的情况下，也不能排除PJI。因此，实验室关节滑液培养的分析有待进一步提高。其次，当高度怀疑PJI，需行关节穿刺抽取关节滑液测定WBC的数目，关节滑液的WBC增高往往提示有PJI。最近多项研究表明，关节滑液中的WBC对于关节假体周围感染具有较高的敏感性和特异性。如果关节滑液中的WBC＞1700cell/L，并且中性粒细胞的百分比＞60%～65%，就高度怀疑 PJI[6]。最后，对于冰冻切片诊断标准存在争议。一项研究发现如果把每高倍镜下发现5个中性粒细胞定义为阳性，诊断敏感性尚可，但是特异性较低，而且假阳性率较高[7]。近年来关节滑液指标也是受到广泛研究，其中关节滑液CRP、-防御素、白细胞酯酶（leukocyteesterase，LE）、关节滑液白细胞（WBC）计数和多形核细胞计数（PMN%）、分子生物学手段如PCR技术等展现出了良好的诊断价值。本文就对这些最新的滑液标志物及其检测方法作一综述。

1 关节滑液白细胞（WBC）计数及多形核细胞计数（PMN%）

滑膜液WBC计数和PMN%是感染早期就会出现变化的指标，也是诊断PJI的生物标志物之一。目前许多组织提供的PJI诊断指南，也都包括了滑膜液WBC计数和PMN%。但是关于滑膜液 WBC计数和 PMN%的诊断阈值的数据很少，所以现在对其研究重点在于确定其阈值。KimSang-Gyun等[8]通过回顾性研究确定了滑膜WBC计数2个最佳截断值，当滑膜WBC截断值为11 200 cell/L，诊断急性PJI的灵敏度最高（100%），特异性最高（98.9%），当截断值为16 000 cell/L时，最佳阳性预测值和阴性预测值分别为100%和99.5%。Hoiby等[9]确定了PMN%的最佳截断值在全膝关节置换术后和全髋关节置换术后分别为 60.5%和66.1%。此两个研究所得到的阈值都来源于小样本，具有一定的参考意义，仍需多中心、大样本量的研究证据支持。同时也有研究发现在阈值附近时，诊断的准确性将大幅下降[10]。因此在临床应用时要注意区分膝关节还是髋关节，因为两者的阈值是不同的，还要注意当检测值在阈值附近时，要联合其他指标进行诊断。除此之外，在金属对金属假体功能障碍和存在腐蚀反应情况下，由于含有吞噬金属颗粒的单核细胞会干扰某些实验室仪器，会导致滑膜液WBC计数和 PMN%的结果不可靠[11-12]。以往使用抗生素也会对滑膜WBC计数和PMN%的诊断价值产生负面影响[13]。

2 关节滑液CRP

CRP是一种长期存在于血清中的蛋白质，作为感染的一种指标，它已经在临床上被广泛应用。当感染发生时，升高的血清CRP向关节的扩散可能导致滑膜液CRP升高，局部CRP可以增强补体激活和吞噬作用，是CRP发挥抗菌作用的理论依据[14-15]。Parvizi等[16]基于以上理论设计了对63例翻修或初次关节置换术患者的前瞻性研究，发现感染组与非感染组的滑膜CRP平均值差异有统计学意义（＜0.0001），且在阈值9.5 mg/L时，敏感性为85%，特异性为95%。这与许多研究得出的结果相似，表明滑液CRP对于PJI的诊断具有较高的敏感性和特异性。但是也有4%的感染者滑液CRP表现正常，使其在单独诊断PJI时受到质疑[12]。因此，与其他指标联合诊断是一个新的趋势，其中与血清IL-6联合诊断的价值相对较高。当滑膜CRP与血清IL-6联合检测时，同时阳性几乎排除了PJI的假阴性检测[17]。当与滑液标志物联合时能显著纠正假阳性，Deirmengian等[18]对 -防御素进行研究时发现存在5例假阳性，但是当联合滑液 CRP时，5例假阳性得以纠正。说明滑液CRP与其他实验室指标联合时可能具有更高的诊断价值。

3.2 -防御素的检测方法

测量滑膜液中的 -防御素有两种方法：基于酶联免疫吸附试验的免疫测定法和基于侧向流动装置的侧向流动测定法。Bonanzinga等[24]利用免疫测定法进行了前瞻性研究， -防御素免疫测定的敏感性为97%，特异性为97%，阳性预测值为88%，阴性预测值为99%。Berger等[25]利用侧向流动测定法进行研究，侧向流动测定的灵敏性为97.1%，特异性为 96.6%。阳性预测值为 91.7%，阴性预测值为98.8%。 -防御素的两种检测方法都展现出了超高的敏感性和特异性，但不是对比研究，并不能说明哪种方法更有优势。最近一篇研究对两种检测方法的荟萃分析显示侧流试验的合并敏感性（0.774）和特异性（0.913）均低于免疫定性分析的合并敏感性（0.953）和特异性（0.965）[26]。但是与免疫测定法相比，侧流检测装置已有商品化的试剂盒出现，其检测方便、快捷，而且价格更容易被患者接受等优点[27]。因此，侧向流动法虽然灵敏性和特异性稍低，但是更适合临床应用。

4 白细胞酯酶

白细胞酯酶（leukocyte esterase，LE）主要存在于中性粒细胞内，是中性粒细胞分泌的一种特异性酶，人体其他白细胞不会分泌此酶，所以可以通过检测此酶，来确定是否存在大量中性粒细胞，确定是否存在感染。因此，2014年美国骨肌系统感染协会也把LE和关节液白细胞计数一同加入诊断PJI的次要标准之中[28]。Wetters等[29]利用LE比色试纸直接检测关节液，其敏感性为92.9%，特异性为88.8%。可以认为关节液LE比色试纸是诊断PJI的敏感工具，而且其快速、简便、廉价，但是同时也发现其容易受到滑膜液中的血液或碎片污染而无法阅读，使其在应用时受到了很大的局限性。Aggarwal等[30]描述了一种简单、廉价和有效的方法能有效避免血液的干扰，就是关节滑液离心后再进行LE试纸检测。结果在所有的病例中，无论是化脓性的还是无菌的，滑膜液离心后 LE试纸试验与直接试纸比色的结果是100%一致的。表明LE测试的准确性不受离心影响，为进一步研究提供了可靠的方向。此外，对于LE的测定还有尿LE试纸，通过尿中LE水平来反映关节液中的LE的水平，并以此辅助诊断PJI。但是研究发现，尿LE试纸的灵敏度较低，常常无法检测出滑膜液中丰富的LE水平，不能排除PJI[31]。

5 滑液细菌基因片段检测

滑液细菌基因片段检测是近年来被广泛研究的诊断PJI的一种新方法，其利用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）对所采集的关节液进行核酸扩增试验，直接检测病原体的DNA和RNA，可以避免抗生素的影响，而且非常快速。常规PCR是对细菌DNA进行测定，由于细菌生物膜的存在，敏感性和特异性较低，甚至低于常规细菌培养[32]。而超声处理破坏细菌生物膜后再进行PCR检测，其敏感性和特异性明显优于培养，甚至高于超声处理液培养，在引起假体周围感染的致病菌是低毒致病菌时，优势更加明显[33-34]。除此之外，多重PCR及逆转录PCR也被证实能够提高PCR诊断准确性。

5.1 多重引物PCR技术

多重引物PCR技术顾名思义就是联合应用多组特异性引物，每组引物都可以与细菌DNA不同区域的特定靶点相结合，可以有效避免常规PCR使用单一引物检测所造成的敏感性和特异性低的问题。一项利用多重PCR技术对被确诊为PJI患者进行感染和病原菌检测的小样本研究发现：多重引物 PCR技术实现对感染及病原菌100%的诊断[35]。虽然是小范围研究，结果的可靠性有待商榷，但是其可以表明多重PCR对提高诊断的准确性还是有积极的意义。由于目前多重引物PCR技术的研究还不够完善，缺点也很明显。就目前报道来看，多重引物PCR技术最大的缺点是诊断敏感性和特异性不能兼备[36]。

5.2 逆转录PCR技术

逆转录PCR技术通过RNA而非DNA诊断感染。之所以逆转录PCR技术能提高诊断准确性是因为细菌DNA结构比较稳定、半衰期长、不易降解，容易受到死亡细菌的影响，造成假阳性率增高，而细菌RNA则恰恰相反，因此不易受到死亡细菌的影响，准确性和可靠性较高[37]。Fang等[38]对疑似发生PJI并最终行翻修关节成形术且符合纳入、排除标准的患者进行术前穿刺或术中采集，获得滑膜液。对每个滑膜液样本进行基于DNA和RNA的PCR分析，比较两种PCR方法的诊断效率。得出基于DNA的PCR检测对于抗生素治疗后的可疑PJI患者具有较高的敏感性，基于RNA的PCR可降低DNA检测的假阳性率。细菌RNA分为三种即rRNA、mRNA、tRNA。目前研究最深入的是16s rRNA和23srRNA。因为rRNA是细菌RNA中含量最多且分子量最大的，比较容易检测。其次细菌内mRNA的合成量非常少且在离体提取过程中，大量的 mRNA很快就会被降解，大多时候检测不到，导致诊断敏感性不高，而rRNA相对较稳定，经提取过程后仍可保持高浓度[39]。最后是不同种类细菌的rRNA与mRNA在结构上有很大不同，细菌rRNA结构上存在特异的高度保守区域，不同的细菌其保守区域是不同的，因此通过检测保守区域的目的基因可以区别不同的细菌。而不同细菌的mRNA结构上几乎不存在相类似的特异性保守区域，对不同的细菌没有辨别作用。细菌内的rRNA也分为三种，分别为5s rRNA、16s rRNA、23s rRNA，其中5s rRNA仅含有120个核苷酸，相对分子量太小不便于实验过程中进行序列分析，所以有关此方面的研究，大多选取16s rRNA和23s rRNA作为研究对象。

6 总结

与传统血清学检测、影像学检查相比，关节滑液检测对于PJI的诊断有着巨大的优势。滑液标志物具有较高的敏感性和特异性，诊断的假阳性率及假阴性率较低，诊断的准确性较目前临床常用指标较高。滑液标志物也较少受到全身情况和使用抗生素的影响，同时也可以直接对病原体进行检测，能够早期诊断并及时给予相应治疗，这能显著改善PJI患者的预后。但是目前滑液标志物的研究还不完善，还有许多不足之处。有些滑液标志物只能在翻修术中获取，不能指导术前诊断，合理安排治疗方案。其次是有些检测方法还不够成熟，在对结果的解释时存在争议，不适于临床应用，而且有些检测需要的成本较高，对于非大型医院及贫困患者来说，负担不起。目前，滑液标志物的研究有相当部分是小样本量的研究，结论的可靠性受到质疑。因此，未来滑液标志物的研究应该趋向于多中心、大样本量的研究，同时在对其检测方法在保证准确性的前提下应该趋向于适用临床。滑液标志物相互联合或者与血清学标志物联合也是一个重要的方向，应该深入研究，并加大对 -防御素的研究，这是目前最有价值的滑液标志物。