苗药痛风停对痛风性关节炎模型大鼠炎症因子及滑膜病理的影响

1.贵州中医药大学第二附属医院，贵州 贵阳 550001；2.贵州中医药大学，贵州 贵阳 550001

痛风性关节炎(goutyarthritis，Gout)是尿酸盐晶体沉积于人体内所导致的一种炎性疾病，急性期以关节红、肿、热、痛为主要临床特征，最终可导致关节变形、骨骼损毁，甚则等影响到内脏器官功能，出现肾功能衰竭[1]。研究显示尿酸盐结晶作为炎症激发因子，通过Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)/髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)信号途径诱导炎症反应，机体生成白细胞介素(Interleukin，IL)、肿瘤坏死因子ɑ(Tumor necrosis factor，TNF-ɑ)等多种细胞因子，导致炎症瀑布反应[2]。《丹溪心法》中记载：“痛风者，四肢百节走痛，方书谓之白虎历节风证是也”，认为是风、热、痰、湿相互胶结为患，阻滞经脉气血所致；苗医认为痛风属“热经病”，多由于“风、热、火、湿”等邪气炽盛、血脉受阻，邪毒留滞筋骨所致，其认识与祖国医学殊途同归。治疗用药上多以流转气血、清热解毒、去除邪热为法，达到“赶邪”的目的。我科于临床中借鉴中医、苗医理论研创了“痛风停”方，该方中三七草、大泽兰、田七草、观音草、芭蕉根等药物属苗医药范畴，能“赶邪祛毒、行血消肿”，配合石膏、虎杖、黄柏等药物，达到活血散结、清热解毒、利水消肿的目的，临床中发现苗药“痛风停”方能较好的减轻痛风性关节炎急性期炎性肿胀、疼痛。本研究通过建立大鼠痛风性关节炎模型，观察痛风停对血清TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等炎症因子及关节滑膜组织的影响，探讨苗药痛风停方对痛风关节炎的抗炎作用机理。

1 实验材料

1.1 实验动物及分组 成年雄性SD大鼠72只，清洁级，体重(240±20)g，购置于重庆腾鑫生物技术有限公司，证号SCXK(京2013-0007)。所有动物饲养于贵阳中医学院实验动物中心，同等饲养条件。按随机数字分组方法分为空白对照组、模型对照组、痛风停低剂量组、中剂量组、高剂量组和秋水仙碱对照组共6组，每组12只。

1.2 主要材料及设备 实验药物苗药痛风停汤由三七草(锐徒清)30 g、大泽兰(锐米菜)15 g、田七草(锐天梯)15 g、观音草(锐油沙)15 g、芭蕉根30 g等药物组成(由贵州中医药大学第二附属医院提供)。对照药物秋水仙碱片(北京嘉林药业股份有限公司，批号：20161001)；尿酸钠(美国Sigma公司，批号：U2875-5G)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司，批号P0010S)；DBA、PV-9000(北京中杉金桥生物)；IL-1、IL-6、IL-8检测ELISA试剂盒(南京建成生物工程研究院)；切片机(德国莱卡，型号：RM2015)，显微镜(日本奥林巴斯，型号：BX51T-PHD-J11)；低温高速离心机(SCILOGEX，型号：D3024R)；自动酶标读数仪(美国BioTek公司)；脱色摇床(国立常州试验设备研究所)；超净工作台(苏洁净化有限公司)。

2 实验方法

2.1 药物制备 将上述苗药加水1000 mL浸泡1 h后煎煮30 min，再加水500 ml煎煮30 min，两煎混合过虑后浓缩至含生药物1 g/mL，储存备用。秋水仙碱取适量加蒸馏水配置成1 g/mL混悬液，储存待用。

2.2 造模方法 按照Mc Carty DJ的造模方法[4]，除空白对照组外，其余各组实验动物用20%乌拉坦(5 mL/kg静脉注射)麻醉，然后将大鼠双侧膝关节周围脱毛，消毒皮肤，轻弯曲膝关节，于关节正中或侧方进针，用6号注射针将尿酸钠溶液10 mg(0.4 mL)及多粘菌素B 0.1 mL(10U/mL)注入大鼠膝关节腔，制备急性痛风性关节炎动物模型。造模成功后，病变关节明显肿胀、发热，患肢活动受限。

2.3 给药方法 痛风停方的成人(60 kg)每日剂量为生药1.25 g/kg，根据人与大鼠体质量确定大鼠的等效剂量为中剂量(7.5 g/kg)，等效剂量的1/2倍为低剂量(3.75 g/kg)，等效剂量的2倍为高剂量(15 g/kg)。阳性药对照组秋水仙碱取等效剂量30 mg/kg[5]。从造模第1天开始，连续灌胃7 d，每天分2次给药，模型对照组和空白对照组灌服等量生理盐水。

2.4 观测指标

2.4.1 各组大鼠一般情况观察，包括活动、精神状态、毛发、进食、反应能力等方面。

2.4.2 外周血TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8浓度检测 股动脉采集外周血，离心后收集血清送检，使用ELISA检测方法对TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8进行检测，严格按照ELISA试剂盒操作说明书步骤进行操作。

2.4.3 关节滑膜组织病理检测 取各组大鼠膝关节滑膜组织，经固定后，常规石蜡包埋，4μm切片，常规用二甲苯脱蜡，经各级乙醇处理至水洗，然后染色、固定。具体操作步骤严格参照实验步骤进行。

3 结果

3.1 一般情况 成功复制痛风性关节炎大鼠模型，模型组大鼠明显动作迟缓，反应迟钝，活动量明显减少，食量减少，精神萎靡，毛发无光泽。与模型组相比，痛风停汤中、高剂量组与秋水仙碱组大鼠一般情况均较治疗前明显改善，进食量较多，反应良好，活动量接近正常。

3.2 痛风停方能够降低模型大鼠外周血IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α的浓度 比较各组大鼠外周血检测结果，与空白组比较，造模组大鼠血清IL-1、IL-6、IL-8、 TNF-α显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，痛风停低、中、高剂量组及秋水仙碱组均有显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)；痛风停高剂量组检测结果低于秋水仙碱组，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表1。

表1 各组大鼠外周血IL-1、IL-6、IL-8、 TNF-α浓度

续表1 表1 各组大鼠外周血IL-1、IL-6、IL-8、 TNF-α浓度

注：与空白组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与秋水仙碱组比较，cP<0.05。

3.3 各组大鼠关节滑膜病理 与空白组比较，模型组滑膜组织增厚，大量淋巴细胞浸润，血管增生；与模型组比较，痛风停低剂量组滑膜增生、淋巴细胞浸润均较轻，痛风停中、高剂量组滑膜增生则不明显，淋巴细胞浸润显著减少，秋水仙碱组与痛风停低剂量组改变近似。如图1～6所示。

4 讨论

痛风性关节炎患病率逐年增加，发病年龄也趋向年轻化，而尿酸盐是炎症诱发的启动因素。研究显示痛风的发生机制较多，其中TLRs/MyD88炎症通路较为集中[6]。机体内尿酸盐晶体暴露后诱导TLRs/MyD88通路激活，触发组织细胞释放炎症因子TNF-α、IL-l、IL-6、IL-8、干扰素γ等，诱使中性粒细胞脱颗粒和单核巨噬细胞聚集、吞噬[7-10]，并激活NF-κB炎症通路[11]，使炎症反应持续放大。

IL是一类具有多重功效的细胞因子，可由多种细胞产生，在炎症的发生、发展中起着重要作用。IL-1是一种由单核细胞、巨核细胞分泌，常常和TNF-α共同发挥“核心”致炎的作用，是痛风主要的促炎因子[12]；同时IL-1还诱导内皮细胞表达粘附因子，使白细胞聚集于关节腔内[13]。IL-6主要由内皮细胞、单核细胞等产生，并刺激B细胞产生抗体，以激活效应性T细胞，还可以诱导血管上皮细胞形成血管翳，激活血管内皮细胞上的粘附因子[14]。IL-8是一种趋化性细胞因子，主要是由单核细胞、上皮细胞等分泌，参与炎症和体内的免疫防御反应。研究证实[15-16]上述三种白介素在痛风性关节炎的炎症发生、发展中起着重要作用。TNF-α主要由单核/巨噬细胞产生，是炎症反应过程中出现最早、最重要的炎性介质，能激活中性粒细胞和淋巴细胞，调节并促使其他细胞因子的合成和释放[17]，与IL-l、IL-6、IL-8形成联动，诱导炎症呈瀑布样发展。因此，我们认为TNF-α、IL-l、IL-6、IL-8等炎症因子是在痛风性关节炎炎症反应急剧发生发展的重要介质，对上述炎症介质的抑制，是有效减轻痛风炎症的手段。

苗医理论认为痛风关节炎是由于各种原因导致“邪毒”、“风毒”、“火毒”及“瘀毒”等侵袭所引起，属于“热经病”范畴，治疗当予“赶毒”(玛汝务翠)为法，痛风停方源于苗族经验方，由三七草(锐徒清)、大泽兰(锐米菜)、田七草(锐天梯)、观音草(锐油沙)、芭蕉根、虎杖、生石膏、黄柏等组成，全方具有祛邪解毒、活血化浊、清热利水、消肿散结之效，可有效减轻痛风患者关节疼痛，可有效降低患者炎症指标[18-19]。本实验结果显示，造模大鼠血清IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α浓度显著升高，且滑膜组织增生、淋巴细胞浸润，经苗药痛风停治疗后，能减轻大鼠关节炎症反应，显著降低外周血中IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α的浓度，并抑制关节滑膜细胞增殖，充分说明苗药痛风停通过抑制机体多种炎症因子的释放，从而控制痛风性关节炎的炎症反应。