新疆NADC30-like PRRSV的分离鉴定及遗传变异分析

赵洁雅 黄炯 王沅 汪萍 参都哈西 古丽尼尕儿·艾尼 马文戈 夏俊

摘    要：为了探明研究新疆地区猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）NADC30-like病毒株XJTK的遗传变异特征，本试验分离病毒株后对该病毒的Nsp2和ORF5基因进行克隆和测序，其片段大小分别为648 bp和603 bp，其中Nsp2基因存在3处不连续共393个核苷酸的缺失，分别缺失333，57和3个核苷酸，完全符合NADC30-like毒株的基因特征;将病毒株XJTK与已知北美型PRRSV代表株VR2332，高致病性PRRSV国内代表株JXA1、TJ，美国分离株NADC30，及NADC30-like国内代表株HENAN-HEB、CHsx1401进行序列比对表明，XJTK株Nsp2和ORF5基因核苷酸序列与参考株同源率分别为36.4%～90.3%和83.7%～93.0%，进一步遗传进化分析表明，其与PRRSV毒株VR2332、JXA1和TJ株亲缘关系较远，与美国分离株NADC30及国内NADC30-like代表株CHsx1401和HENAN-HEB亲缘关系较近，同属于NADC30-like亞群，但仍属于相对独立的分支。本研究是新疆首次证实猪群中存在NADC30-like PRRSV，可为该地区猪繁殖与呼吸综合征的防制提供参考依据。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒;NADC30-like;遗传变异分析

中图分类号：S828; S432.4+1          文献标识码：A          DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2019.12.010

Abstract： In order to find out the genetic variation characteristics of pig reproductive and respiratory syndrome virus （PRRSV） NADC30-like isolate XJTK strain in Xinjiang， the Nsp2 and ORF5 gene of the virus was cloned and sequenced with synthetic primers. The results showed that the fragment sizes of Nsp2 and ORF5 were 648 bp and 603 bp respectively， in which the Nsp2 gene had three discontinuous deletions of 393 nucleotides， including 333， 57 and 3 nucleotides respectively， matching with the genetic characteristics of NADC30-like strain. The virus strain XJTK was compared with the known PRRSV representative strain （VR2332， JXA1， TJ， NADC30， HENAN-HEB and CHsx1401） through the sequence alignment and genetic evolution analysis. The results showed that the nucleotide sequence homology rates between Nsp2， ORF5 gene and the reference strain were 36.4%～90.3% and 83.7%～93.0%， respectively. Further genetic and evolutionary analysis showed that XJTK strain was closely related to NADC30， CHsx1401， and HENANHEB， which were belonged to NADC30-like subgroup， but still belonged to a relatively independent branch. This study confirmed the existence of NADC30-like PRRSV in pig populations in Xinjiang， which could provide a reference for the prevention and control of pig reproductive and respiratory syndrome in this area.

Key words： pig reproductive and respiratory syndrome virus; NADC30-like; genetic variation analysis

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是一种由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的传染病，可导致妊娠母猪流产和各年龄段猪呼吸障碍等。自20世纪80年代该病在美国和加拿大出现后，在全球范围内传播，已成为全球猪病防控上的一大难题[1-2]。疫苗接种作为目前预防PRRSV感染的主要措施，主要包括灭活疫苗和弱毒活疫苗两种[3-6]，前者免疫效果较差，而后者安全性较低且可能出现不同程度突变的新毒株感染，综合导致疫苗的预防效果并不理想，使猪繁殖与呼吸综合征的防控日益困难[7]。

PRRSV为动脉炎病毒科（Arteriviridae）动脉炎病毒属（Arterivirus）的成员，是大小约15 kb的单股正链RNA病毒，含有8个开放阅读框（Open Reading Frame，ORF），其中ORFl（ORFla和ORF1b）编码病毒RNA复制酶，ORF2～ORF7分别编码病毒结构蛋白GP2、GP3、GP4、GP5、M和N[8-9]。通过对PRRSV序列进行比较，各分离株基因组间变异广泛，尤以Nsp2和ORF5基因的变异最大[10]。在我国，高志强等[11]在PRRSV分离株BJ-4、HB-1（sh）/2002和HB-2（sh）/2002的全基因测序中，首次发现Nsp2存在蛋白缺失现象，这3株Nsp2推导的氨基酸序列还存在多位点置换，变异主要发生在保守氨基酸区域[12]。2006 年，在国内暴发的PRRSV强毒株（HP-PRRSV）中，发现Nsp2区域中B细胞表位和T细胞表位中有30个氨基酸的不连续缺失[13-14]。2008年，苏贵成[15]通过对分离得到的PRRSV新疆毒株进行序列分析，发现Nsp2有两处共29个氨基酸发生变异。

2018年底，新疆某猪场猪繁殖与呼吸綜合征病毒（PRRSV）疫苗免疫的母猪群突发大规模流产，本研究以流产胎儿肺脏为材料，分离PRRSV毒株，采用PCR方法对其进行初步鉴定，并与已知的PRRSV代表毒株进行序列比对和遗传进化分析，旨在为新疆地区猪繁殖与呼吸综合征流行病学调查及防控提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

胎牛血清、胰蛋白酶、DMEM 培养基、抗生素购自Hyclone公司;Marc-145细胞由新疆畜牧科学院兽医研究所（新疆畜牧科学院动物临床医学研究中心）提供;TRIzol试剂购自Invitrogen公司;DNA Marker DL 2 000购自宝生物工程（大连）有限公司;RT-PCR一步法试剂盒购自Promega公司;引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 病料采集及处理

PRRSV疑似病料采自新疆某PRRSV疫苗免疫猪场流产胎儿肺脏，共10份。取病料约5.0 g，置于研磨器，加入1.5 mL灭菌生理盐水，研磨成混浊液。将混浊液转移至2 mL灭菌离心管中，8 000 r·min-1 4 ℃离心5 min，弃沉淀，取上清液-20 ℃冻存。

1.3 病毒分离方法

无菌取上面收集的肺脏病料，加入适量的PBS液，用研磨器研磨为肉糜状，加入4倍组织培养液，反复冻融3次，高速离心取上清液，微孔过滤除菌，当Marc-145细胞长至70%～80%时，弃去细胞培养液，加入500 μL病料滤液，37 ℃吸附1 h，吸取病料滤液后补加DMEM（培养基）完全培养液继续培养，每天观察细胞病变（CPE）。

1.4 PRRSV XJTK株Nsp2和ORF5基因扩增及序列分析

样品核酸提取按照病毒基因组提取试剂盒来操作。25 μL RT-PCR反应体系包含10×One Step RNA Buffer 2.5 μL，10 mmol·L-1 dNTP Mixture 2.5 μL，25 mmol·L-1 MgCl2 5 μL，5 U·μL-1 AMV RTase XL 1 μL，5 U·μL-1 AMV-Optimized Taq 1 μL，40 U·μL-1 RNase Inhibitor 0.5 μL，20 μmol·L-1上下游引物（表1）各0.5 μL，核酸模板1 μL，最后加入RNase Free dH2O至终体积25 μL。RT-PCR反应程序如下：50 ℃ 30 min;94 ℃ 2 min;94 ℃ 30 s，56.8 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，进行30个循环;72 ℃ 10 min，4 ℃保存。1.0%浓度琼脂糖凝胶电泳约20 min后观察结果。RT-PCR 扩增产物纯化后送上海生工生物工程有限公司进行测序。将获得的Nsp2和ORF5基因序列用DNA Star分析软件与所选参考毒株核苷酸序列进行同源性比较及遗传进化分析，并绘制进化树。

2 结果与分析

2.1 病毒分离结果

将处理过的病料接种于Marc-145细胞，培养至第4代出现典型的CPE，表现为细胞聚集成丛，之后固缩、变圆、部分细胞紧缩呈索状，最后皱缩、脱落（图1）;细胞对照未见异常（图2）。

2.2 PRRSV XJTK株Nsp2和ORF5基因的RT-PCR扩增

本研究从分离到的病毒株中提取基因组后进行了PRRSV Nsp2和ORF5基因扩增，RT-PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，结果显示扩增片段大小与NADC30-like的Nsp2和ORF5相符，分别为648 和603 bp（图3）。

2.3 PRRSV XJTK株Nsp2基因测序及比对

PRRSV病毒主要分为2种基因型：Ⅰ型（欧洲型）和Ⅱ型（美洲型）[3]。将Nsp2基因克隆至T载体后测序，所得序列与北美型PRRSV代表株VR2332，高致病性PRRSV国内代表株JXA1、TJ及美国分离株NADC30进行比对。结果显示，PRRSV XJTK株与参考毒株VR2332相比，Nsp2基因存在3处不连续共393个核苷酸的缺失，分别缺失333，57和3个核苷酸，这样的缺失与NADC30株完全相同，即完全符合NADC30-like毒株的基因特征。

2.4 PRRSV XJTK株Nsp2和ORF5基因同源性及遗传进化分析

PRRSV XJTK株Nsp2和ORF5基因序列与国内外代表株（北美型PRRSV代表株VR2332，高致病性PRRSV国内代表株JXA1、TJ，美国分离株NADC30，NADC30-like国内代表株HENAN-HEB、CHsx1401）进行同源性和遗传进化分析。同源性分析结果（图4、图5）显示，XJTK株Nsp2和ORF5基因核苷酸序列与参考株相比同源率分别为36.4%～90.3%及83.7%～93.0%，均表现为与JXAl株的同源性最低，与NADC30株同源性最高。Nsp2和ORF5基因遗传演化分析结果（图6、图7）显示，XJTK株属基因II型，与北美型代表株VR2332及高致病性PRRSV毒株JXA1和TJ亲缘关系较远，与美国分离株NADC30及国内NADC30-like代表株HENAN-HEB和CHsx1401亲缘关系较近，同属于NADC30-like亚群，但仍属于相对独立的分支。

3 结论与讨论

自1996年我国首次报道从猪群中分离PRRSV以来，该病就成为危害我国养猪业健康发展的主要疫病之一[16-17]。2006年夏天，由变异的PRRSV引起的无名高热病席卷几乎全国所有养猪地区，造成重大经济损失。研究证实，该病原为Nsp2基因处缺失不连续30个氨基酸的毒株。为此，相关研究人员先后研制出高致病性PRRSV灭活疫苗及弱毒疫苗，并且在全国范围内强制免疫，在很大程度上遏制了高致病性PRRSV在我国的流行。但从2013年开始，多个省份又相继报道在猪场发现了与美国NADC30毒株同源性很高的毒株，研究人员将其命名为NADC30-like毒株[18]。NADC30-like毒株最显著的基因特征是Nsp2区存在131个氨基酸的不连续缺失，随后的分子流行病学调查研究也显示，NADC30-like毒株在我国多个地区逐渐呈流行态势[19-20]。

本研究在猪场爆发母猪群突发大规模流产时，对可能导致母猪流产的主要常见病原（PRRSV、猪瘟、猪伪狂犬、猪圆环病毒、猪细小病毒、弓形虫与布鲁氏菌病）进行了排查，仅PRRSV呈阳性，其余均为阴性，这个结果也证实了免疫工作比较到位的规模化猪场引起母猪大规模流产的病原依然是PRRSV。当前猪场感染PRRSV具有多种形式：弱毒疫苗的返强和持续感染、野毒感染、野毒与弱毒疫苗共感染、外来毒（如NADC30等）感染、野毒与外来毒混合感染、各种重组病毒感染等。本试验克隆了PRRSV病毒株的Nsp2和ORF5基因，并与已知代表毒株进行序列比对及遗传进化分析，结果显示，本次疫情的病原PRRSV XJTK虽然与NADC30及NADC30-like国内分离株同源关系很近，属于NADC30-like亚群，但在遗传进化树中仍然处于相对独立的分支。这可能与新疆地处祖国边境，地理位置偏远导致当地PRRSV与国内其它省份PRRSV在基因进化上差异较大所致，因此当地野毒与NADC30-like毒株重组后产生的病毒也极具本土特异性。目前，我国的PRRSV疫苗主要是以经典型和高致病性PRRSV为亲本研发而来的，对NADC30-like毒株没有或仅有微弱的交叉保护力，这也解释了为何猪场在应用免疫PRRSV疫苗后依然会暴发由PRRSV感染而导致此次疫情的原因，长期注射疫苗可能造成新型变异毒株的出现，从而降低免疫效果，因此要合理使用减毒活疫苗。

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