热带地区作物秸秆类青贮饲料的调制与发酵品质

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(1.日本国际农林水产业研究中心，日本 茨城305-8686； 2.中国农业大学动物科学与技术学院，北京 100083)

影响热带地区家畜生产的主要因素是饲料短缺，特别是在旱季表现极为明显[1]。在热带地区，反刍家畜粗饲料的主要来源是天然牧草和农作物副产品。用劣质的粗饲料饲喂牛，会导致牛奶和肉品质下降[2]。近年，许多饲料作物、牧草和农作物副产品的应用技术已经广泛应用，并且有学者对它们的各种生产条件、营养价值和动物生产性能进行了深入研究[3]。通常，热带农作物只有在雨季才能生长良好[4]。就饲料与动物生产系统而言，热带地区的饲料的制备应在雨季作物收获之后，有效利用其秸秆资源调制青贮，并可长期贮藏为干旱季节备用，从而为反刍动物提供新鲜的青贮饲料；因此，青贮饲料的调制和贮藏技术被认为是解决热带地区动物饲料短缺问题的有效途径[5]。

玉米(ZeamaysL.)秸秆和甘蔗(SaccharumofficinarumL.)秸秆是热带地区主要的农作物副产品，通常收获后被丢弃在田间，干燥后进行焚烧处理或者当做肥料使用[6]。玉米是一种分布极为广泛的农作物，作为粮食作物进行收获时，植株茎、叶和穗轴部分占玉米全株干物质的40%[7]。甘蔗上部秸秆是糖类作物生产的主要副产品，占甘蔗全株干物质中的15%～25%[8]，在热带地区，玉米秸秆和甘蔗秸秆是廉价而蕴藏量极大的饲料资源，可作为新鲜或者干燥的秸秆饲料饲喂家畜。

饲料作物在青贮发酵过程中产生乳酸抑制有害微生物的繁殖，从而使青贮饲料得到很好的保存。通常，热带牧草或饲料作物在青贮过程中存在含水量高和可溶性糖含量低的问题，会影响高品质饲料的调制和保藏[9]。随着生物添加剂(如乳酸菌接种剂和纤维素酶)的开发和利用，青贮饲料的技术革新受到广泛关注。显然，这些青贮添加剂可以有效地提高发酵品质和贮藏效率，并且可提高家畜的生产性能。理论上讲，纤维素酶可以提高纤维的降解效率，增加可溶性糖的含量，使其作为乳酸菌发酵的底物而产生更多的乳酸，从而使饲料作物的pH值显著下降，使青贮饲料得到有效的保存[10]。

为了有效地利用非洲本地饲料资源，生产优质并可长期储存的青贮饲料，本研究以收获后的新鲜玉米秸秆和甘蔗秸秆为原料，对其分离出的乳酸菌进行鉴定，并对其青贮发酵品质进行分析。为提高青贮饲料的发酵品质，本研究利用乳酸菌接种剂和纤维素酶制剂等微生物添加剂制备了青贮饲料，并对其添加效果进行了评价。

1 材料和方法

1.1 青贮原料

2017年9月，在非洲莫桑比克马普托的玉米生产区和工业制糖区获得的玉米秸秆和甘蔗秸秆。

1.2 青贮添加剂

根据制造商的使用方法，将商用乳酸菌添加剂Chikuso-1(CH，植物乳杆菌，雪印种子有限公司，日本札幌)和枝顶孢属纤维素酶(AC，Acremonium纤维素酶，明治制果制药有限公司，日本东京)作为青贮饲料添加剂进行使用。乳酸菌添加剂的菌种，是从牧草饲料作物中分离出的乳酸菌，在青贮环境下能产生大量的乳酸。纤维素酶的主要成分是葡聚糖酶和果胶酶,其酶活性为7 350 U/g。

1.3 试验设计

此试验设计可分为对照组(Control)、乳酸菌组(CH)、纤维素酶组(AC)、乳酸菌和纤维素酶混合组(CH+AC)4个处理，每个处理3次重复。乳酸菌的添加剂量是每千克饲草中加入5 mg的菌剂，菌群数量是1.0×105(cfu)/g。纤维素酶的添加剂量是每千克饲草中加入10 mg的菌剂和20 mL的水。用去离子水稀释乳酸菌和纤维素酶接种剂，实验组用电子喷雾器(日本Miki Fujiwara Sangyo Ltd.，SSP-5H)去喷洒添加剂溶液，对照组喷洒相同数量的去离子水。

1.4 青贮调制

在收获后，将新鲜的玉米秸秆和甘蔗叶用粉碎机粉碎成长度约为1～2 cm的小段，按照试验设计加入添加剂，添加量以新鲜样品的质量为基础。每个处理称取8 kg左右的样品，然后将其装入20 L的聚乙烯圆桶中，室温(25～38 ℃)避光密封保存60 d后测定发酵品质、营养成分及微生物含量。

1.5 微生物菌数的测量

在超净工作台中将待测样品开袋取样。首先将样品剪碎，混匀，称取20 g至装有180 mL无菌水的三角瓶中，摇床在室温下震荡30 min，速度为180 r/min，将此溶液依次稀释10～10 000倍，均匀进行涂布，MRS培养基在37 ℃厌氧条件下培养48 h，BLB、PDA和NA培养基在37 ℃有氧条件下培养48 h后计数。

1.6 青贮饲料化学成分和发酵品质的测定

取青贮样品20 g，加入180 mL去离子水中，搅拌摇匀，放置4 ℃冰箱中静置24 h，利用pH测定仪(雷磁PHS-3 ℃)测定滤液pH值；采用分光光度法测定氨态氮(NH3-N)含量[12]；有机酸用高效液相色谱法测定[13]。青贮饲料的营养成分按常规方法[14]测定：采用烘箱干燥法测定干物质(DM)含量；采用凯氏定氮法测定粗蛋白质(CP)含量；采用索氏提取法测定脂肪(EE)含量；采用范氏洗涤纤维法测定中性洗涤纤维(NDF)含量；粗灰分(Ash)采用GB6439-92燃烧法测定；碳水化合物(Carbohydrate)的计算公式为Carbohydrate=100-(CP+EE+NDF+Ash)。

1.7 乳酸菌的形态、生理生化试验

利用MRS琼脂培养基将乳酸菌培养48 h后，测定其革兰氏染色和形态学特征，并进行过氧化氢酶接触试验和发酵葡萄糖产气试验，详见参考文献[15]。

1.7.1 耐温试验

将分离的菌株接种到乳酸菌液体培养基中，分别放至5、10 ℃恒温冰箱中培养10 d，在40、45和50 ℃的恒温水浴锅中培养7 d。培养结束后，与不加菌液的乳酸菌液体培养基进行比对，从而对不同温度条件下乳酸菌的生长情况进行对比分析。

1.7.2 耐酸试验

将分离的菌株接种到pH值为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0和9.0的乳酸菌液体培养基上，在30 ℃的恒温培养箱内培养7 d。培养结束后，和不加菌液的乳酸菌液体培养基进行对比，观察乳酸菌在pH值为3.0～9.0的培养基中的生长情况。

1.7.3 发酵葡萄糖产气试验

将分离培养的单菌落接种到含有5 mL的乳酸菌液体培养基玻璃试管中(杜氏小管倒扣在试管液体内)，30 ℃培养48 h，观察小管内产气状况，记录试验结果。

1.7.4 碳源发酵试验

采用Analytical Profile Index (API 50,bioMerieux，France)试验条进行测试，方法依据说明书进行操作。

1.8 数据分析

基础数据整理用EXCEL软件，用SAS (12.0版)软件程序对数据进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 玉米秸秆和甘蔗原料化学成分和微生物构成

2.1.1 化学成分

在进行青贮发酵之前，取新鲜的玉米秸秆和甘蔗秸秆样品，测定其原料中的化学成分含量，测定结果见图1。两种农作物副产品的DM占风干样的比例分别为42%和25%；玉米秸秆和甘蔗秸秆的CP和EE含量基本相同，没有显著性差异(P>0.05)。玉米秸秆的NDF和Ash含量显著高于甘蔗(P<0.05)。

2.1.2 微生物构成

玉米秸秆和甘蔗原料中微生物种类构成见图2。新鲜玉米秸秆和甘蔗秸秆中含有的乳酸菌和大肠杆菌数量为5.00～6.00 lg cfu/g，好氧细菌的菌落数量为8.00 lg cfu/g，酵母菌的菌落数量为5.00～7.00 lg cfu/g，霉菌的菌落数量为3.00～4.00 lg cfu/g。

图2 玉米秸秆和甘蔗秸秆的微生物构成

2.2 青贮饲料发酵品质和生理生化特性

2.2.1 化学成分

玉米秸秆和甘蔗秸秆加入添加剂青贮60 d后，其化学成分含量如图3所示。对于玉米秸秆和甘蔗秸秆的化学成分而言，两种材料添加剂组的CP含量与对照组没有显著性差异(P>0.05)。对于玉米秸秆而言，添加剂组的NDF含量与对照组没有显著差异(P>0.05)。对于甘蔗秸秆而言，与对照组进行对比分析可知，AC和CH+AC处理组的NDF含量显著低于对照组(P<0.05)，CH处理组与对照组没有显著差异(P>0.05)。

图3 玉米秸秆和甘蔗秸秆青贮的化学成分

2.2.2 发酵品质

玉米秸秆和甘蔗秸秆加入添加剂青贮60 d后，其发酵品质(pH和乳酸含量)如图4所示。通过对pH值和LA进行分析可知，玉米秸秆的对照组和添加剂组之间的pH值和LA没有显著差异(P>0.05)，而对于甘蔗秸秆处理组而言，添加剂组的pH值含量显著低于对照组(P<0.05)，LA含量均显著高于对照组(P<0.05)。

图4 青贮发酵60 d的玉米秸秆和甘蔗秸秆的发酵品质

2.2.3 乳酸菌菌种构成与生理生化指标

从玉米秸秆和甘蔗秸秆青贮饲料中分离出的乳酸菌菌种构成比例如图5所示。Lactobacillusplantarum和Weissellancibaria是主要的乳酸菌群落，他们在玉米秸秆和甘蔗秸秆菌株中所占的比例分别超出50%。在青贮发酵60 d后，植物乳杆菌(L.plantarum)为优势菌种，在玉米秸秆青贮饲料AC处理和甘蔗秸秆青贮饲料CH处理中占总菌株的比例分别高于75%，然而对于甘蔗秸秆青贮饲料而言，对照组和AC处理组的优势菌种是西伯利亚乳杆菌，其占总菌株的比例为57%～60%。

图5 乳酸菌的菌种构成比例

生理生化特性和API50 CH发酵糖实验结果见表1和表2。本试验测定了1 500个以上菌株的16S rRNA碱基序列。乳酸菌琼脂平板上分离到97株MRS菌株，通过在乳酸菌琼脂培养液中对不产乳酸的菌株进行检测可知，其革兰氏染色呈阴性和过氧化氢酶呈阳性，因此其中22株不具有乳酸菌特征。其余75株为革兰氏染色呈阳性和过氧化氢酶呈阴性的杆状或球状的细胞形态，利用葡萄糖产气试验确定菌株的同型或异型乳酸发酵形式，并生成D(-)、L(+)或近似等量的D(-)和L(+)-乳酸异构体。通过对16S rDNA碱基序列进行系统分析发现，这些乳酸菌都可归属乳酸杆菌(包括2株)、魏氏菌、肠球菌和微球菌属的菌种。根据形态学，生理生化特性以及16S rRNA基因序列分析，这些分离菌株可鉴定为植物乳杆菌、短乳杆菌、西伯利亚魏氏杆菌、粪肠球菌和酸乳球菌。在系统发育树中，这些分离菌株与标准菌株最近缘，且序列相似度大于99.80%。

表1 乳酸菌生理生化性质

表1(续)

注：“+”表示生长；“-”表示不生长；“W”表示弱生长。

表2 乳酸菌发酵碳源试验

表2(续)

注：“+”，阳性反应；“-”，负反应；“W”，弱阳性反应。

3 讨论

通常，热带牧草的种类不同其化学成分也有所不同，尤其是DM、CP、NDF和WSC的含量。由于一些热带牧草存在水分和LBC高、WSC含量低的问题，因此难以调制成高质量的青贮饲料[1-16]。在本研究中，两种作物秸秆的CP含量基本相同；但玉米秸秆比甘蔗秸秆具有更适宜的青贮特性，其具有水分含量和缓冲能低及WSC含量高的优点。

为了探明农作物秸秆附着微生物数量与青贮发酵品质的关系，本试验对乳酸菌、好氧细菌、大肠杆菌，霉菌和酵母菌5种微生物进行了检测。一般来说，青贮发酵是以自然乳酸发酵为基础，在青贮过程中，由于牧草本身附着的乳酸菌将水溶性碳水化合物转化成有机酸，从而降低pH值，使饲料得到有效的保存。因此，牧草本身附生乳酸菌的数量、种类和特性已成为预测青贮发酵规律的重要指标。当乳酸菌少量存在于牧草或饲料作物时，其自身无法在青贮发酵过程中产生足够的乳酸去降低pH并抑制梭酸菌的生长，由此产生的青贮饲料的品质较差[17]。如图2所示，玉米秸秆中存在着数量相对较高的乳酸菌105(cfu/g FM)，即乳酸菌是优势菌群。因此在青贮发酵过程中不需要使用其他接种剂来控制对照组的微生物数量。与之相反，在本试验甘蔗秸秆中所含的乳酸菌数量较少，只有103的乳酸菌，因此威氏菌是主要的菌群。这个结果表明，玉米秸秆可依靠野生乳酸菌自然发酵，而甘蔗秸秆则需要添加乳酸菌制剂来改善青贮发酵品质。

笔者曾在16S rRNA序列和DNA-DNA杂交实验中，对乳酸菌的鉴定和遗传相关性进行了广泛的研究，并从青贮饲料中成功分离出乳酸菌的新菌种(New species)。以往的研究表明，乳酸杆菌、片球菌、肠球菌、明串珠菌、魏氏菌和乳球菌属彼此之间表现出高度的序列相似性，形成一个与其他细菌相独立的系统发育的群体[18]。本研究中，将代表性菌株置于系统发育树中的乳酸杆菌属(包括2株)、魏氏菌、肠球菌和片球菌中，证实这些菌株属于魏氏乳杆菌属、片球菌属和肠球菌属。这些菌株分别与植物乳杆菌、短乳杆菌、西伯利亚威塞菌、粪肠球菌和酸性乳球菌的标准菌株(Type strain)具有极其近缘的关系。这些菌株的16S rRNA序列相似性均在99.80%以上，与其他标准菌株的相似性均小于97.00%。根据16S rDNA序列分析，这些菌株可归属于植物乳杆菌、短乳杆菌、西伯利亚小肠杆菌、粪肠球菌和酸性乳球菌。事实上，API50 CH数据也支持这一结果，这些菌株与每种近缘标准菌株具有相似的糖源发酵规律。

通常，在青贮发酵初期，一些能够产乳酸的球菌能够创造出适合乳酸杆菌生长的厌氧环境。乳酸杆菌在厌氧环境下，能够繁殖较长时间并产生大量的乳酸。许多研究表明，干酪乳杆菌、植物乳杆菌等同源发酵乳酸菌在促进乳酸发酵和提高青贮饲料发酵品质等方面具有重要作用[19]。在本研究中，所有的玉米秸秆青贮都发酵良好，乳酸含量较高，pH值较低。促成青贮饲料良好发酵的主要原因与玉米秸秆的化学成分和附生乳酸菌的生理特性有密切关联。如图2所示，玉米秸秆的乳酸菌附生数量较多(105cfu/g FM)。此外，分布在玉米秸秆上的优势菌种是野生植物乳酸杆菌，该菌株为同源发酵型乳酸菌，在pH较低条件下会生长良好，乳酸产量也会高于其他菌株。在青贮发酵期间，乳酸杆菌可以利用足够的糖产生更多的乳酸，以降低pH值并抑制有害细菌的生长，从而使得对照组的青贮在内的玉米秸秆青贮饲料能够得到良好的发酵和储藏[20]。与之相反，甘蔗秸秆对照组青贮品质较差，而微生物添加剂处理组的青贮品质较好。此外，甘蔗秸秆对照组的青贮饲料pH值没有下降到4.0以下，允许丁酸菌进行丁酸发酵和氨态氮产生。然而，用乳酸菌或纤维素酶处理的甘蔗青贮饲料的发酵品质优于对照。这些结果可能是用于本研究的纤维素酶可以降解纤维，增加可溶性碳水化合物的含量，使其作为乳酸生产的底物，从而提高乳酸发酵品质。事实上，甘蔗秸秆处理组的NDF和ADF含量的下降也能支持这一论点。本试验的结果显示，如果饲料作物有足够的乳酸菌和糖含量，即使不添加乳酸菌，也能够生产出高质量的青贮饲料；因此，乳酸菌种类和纤维素酶可能会改变和影响青贮饲料的发酵质量。当农作物秸秆中乳酸菌和可溶性碳水化合物含量不足时，需要及时添加乳酸菌和纤维素酶制剂对青贮饲料的发酵进行调控。

近年，在非洲农业生产中，农作物秸秆资源迅速增加，出于对经济和环境的考虑，需要对农作物副产品进行有效的利用。结果表明，利用当地农作物副产物资源制备青贮饲料是一种非常行之有效的发酵工艺[21]。我们的研究结果表明，玉米秸秆在天然青贮发酵过程中因存在有效乳酸菌种可调制成高品质的饲料，甘蔗秸秆通过利用乳酸菌接种剂也能够被制成良好的青贮饲料。两种作物秸秆均含有一定的营养成分，并在青贮发酵过程中得到了很好的保存；因此，作物秸秆作为一种粗饲料资源去解决非洲干旱季节饲料短缺问题具有很大的潜力[22]。

4 结论

玉米和甘蔗新鲜秸秆中富含一定的营养，玉米秸秆附着大量的乳酸菌，具有良好的青贮特性，适合青贮发酵。甘蔗秸秆需添加乳酸菌或纤维素酶制剂进行调贮。这项研究表明，两种农作物秸秆均可以调制成良好的青贮饲料，将其作为粗饲料资源可以有效地解决非洲旱季地区家畜饲料短缺的问题。