磨损颗粒诱导骨溶解的两种动物模型形态学比较研究

赵江博，李燕，田佳宁，郭凤英，王硕，杨超，席向东，陈德胜

(1.宁夏医科大学临床医学院，宁夏 银川 750000；2.宁夏医科大学，宁夏 银川 750000；3.宁夏医科大学总医院骨一科，宁夏 银川 750000)

目前全髋关节置换术和全膝关节置换术是较为成熟的外科手术，可为患者减轻疼痛、改善关节功能和提高生活质量[1-2]。然而，尽管手术技术、假体材料不断改进，但需要进行翻修的患者在逐年增加。磨损颗粒诱导的假体周围骨溶解是导致翻修的最常见原因之一[3]。关于假体周围骨溶解的病理学机制尚未完全明确，并且目前探索假体周围骨溶解的治疗靶点是研究热点，因此能够更好的模拟假体周围骨溶解的病理学机制是实验研究必不可少的条件。本实验对目前常用的小鼠颅骨模型和小鼠气囊植骨模型进行比较性研究，为磨损颗粒诱导骨溶解的动物模型的选择提供实验平台。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 雌性SPF级BALB/c 小鼠50只，8～10周龄，体重在(22±3)g之间，健康状况良好。在宁夏医科大学实验动物中心SPF级动物房饲养，5只/笼。小鼠适应性饲养1周后进行实验。将40只小鼠随机分为小鼠颅骨模型组、小鼠气囊植骨模型组，每组20只。颅骨骨片供体组10只。

1.2 材料与试剂 钛颗粒购自Alfa Aesar公司；苏木精-伊红染液、抗石酒酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，TRAP)免疫组化染色试剂盒购自西安润德生物技术有限公司；4%多聚甲醛、叔丁醇、12.5% EDTA、乙醇、PBS液购自银川润研生物技术有限公司；内毒素检测试剂盒购自上海润成生物科技有限公司。

1.3 实验仪器 显微镜(Olympus，日本)；离心加速机(Salfradent，意大利)；真空烘箱；石蜡包埋机(Olympus，日本)；石蜡切片机(Olympus，日本)；图像分析仪(Leica Q-500，德国)；扫描电子显微镜(H-3400N，日本)。

1.4 实验方法

1.4.1 磨损颗粒的处理 磨损颗粒选用商品化纯钛颗粒，颗粒直径小于20 μm。除内毒素处理：将钛颗粒置于烤箱180℃焙烤6 h，浸泡于无水乙醇，离心后弃去上清液，加入PBS液洗涤3遍，最后加入无菌PBS液，将钛颗粒制成浓度为300 mg/mL的颗粒悬液，用内毒素检测试剂盒，进行内毒素含量检测。

1.4.2 动物模型的建立 小鼠颅骨模型：采用Knocha等的方法建立动物模型，以4%水合氯醛腹腔注射麻醉，麻醉成功后将小鼠固定于手术操作台上，头部备皮、碘伏消毒、铺无菌巾单。沿小鼠颅顶正中矢状线，切开长约10 mm的皮肤及皮下组织。显露1 cm×1 cm范围的骨膜，在骨膜表面注入钛颗粒悬液0.3 mL(300 mg/mL)，颗粒均匀分布于骨膜表面，缝合切口。术后腹腔注射青霉素预防感染。手术中所用的器械，均经过灭菌处理，整个操作过程严格遵守无菌原则。

小鼠气囊植骨模型：采用Geng等的方法建立动物模型。将小鼠腹腔麻醉，待麻醉成功后，在其背部注射2 mL无菌空气形成气囊；之后的6 d内，每天向气囊中注射0.5 mL无菌空气，第7天气囊形成；将颅骨骨片供体组的10只小鼠，颈椎脱臼法处死，及时取出其颅骨骨片(约0.5 cm×0.4 cm)，剔除多余的软组织，沿中线均分两份。将小鼠气囊植骨模型组20只小鼠麻醉后，背部备皮、消毒、铺无菌单，切开气囊，植入颅骨骨片，缝合切口。在植入骨片的气囊内立即注入钛颗粒悬液0.3 mL(300 mg/mL)。术后腹腔注射青霉素预防感染。手术中所用的器械，均经过灭菌处理，整个操作过程严格遵守无菌原则。

1.4.3 组织标本采集 在动物模型建立完成后第14天，手术分别取出小鼠颅骨模型的颅骨骨片和小鼠气囊植骨模型的颅骨骨片及其包裹在周围的囊壁组织(界膜)，每个标本均分2份，一份用4%多聚甲醛固定，用于苏木素-伊红(HE)染色和抗石酒酸酸性磷酸酶(TRAP)染色；另一份保存在预冷的PBS缓冲液中，用于扫描电镜观察。

1.5 组织标本的处理 将完成固定的组织转至12.5% EDTA脱钙液中脱钙处理2周；再将标本进行脱水、二甲苯透明处理后，进行石蜡包埋。将完成包埋的标本进行4 μm连续切片；捞片；烤片。

1.6 组织病理学观察

1.6.1 苏木素-伊红(HE)染色 将烤片取出，常规二甲苯脱蜡和梯度酒精脱水处理。苏木精染色约15min。流水冲洗，冲洗后用1%盐酸乙醇分色。蒸馏水充分冲洗，然后碳酸锂饱和水蓝化。再次冲洗后用1%伊红染色。之后经梯度酒精脱水、二甲苯透明等处理。染色完成后，封片，光镜下观察。

1.6.2 扫描电子显微镜 将获取的小鼠颅骨标本置于2%戊二醛固定2 h后，再用0.1 mmol/L二甲砷酸钠缓冲液冲洗3次，固定过夜。2%锇酸固定后，乙醇、叔丁醇逐级脱水，真空干燥，镀金，扫描电子显微镜观察。

1.6.3 抗石酒酸酸性磷酸酶(TRAP)免疫组化染色 严格遵照试剂盒说明书逐步完成，染色完成后，封片，光镜下观察。

2 结 果

2.1 HE染色结果 HE染色后显示小鼠颅骨模型组颅骨组织表面骨吸收的改变较少，炎性反应较轻，有少量的炎性细胞浸润，钛颗粒存留较少；小鼠气囊植骨模型组植入气囊内的骨块表面骨吸收现象明显，出现炎性反应，有大量炎性细胞浸润，组织中可见钛颗粒(见图1)。

2.2 扫描电镜结果 小鼠气囊植骨模型组颅骨组织表面分布大量的骨吸收凹陷，数量较多，大小不一，形状不规则；同时部分凹陷处有钛颗粒的浸入。采用图像分析仪对骨吸收面积进行采集，统计结果如下，小鼠气囊植骨模型组骨吸收面积(385.30±5.11)nm2，明显高于小鼠颅骨模型组(288.60±4.89)nm2(P<0.05，见图2)。

2.3 TRAP染色结果 TRAP染色后阳性结果示破骨细胞为酒红色。两组比较显示小鼠颅骨模型组破骨细胞数目明显较少且钛颗粒分布，而小鼠气囊植骨模型组破骨细胞数目明显增多(见图3)。统计结果如下，小鼠气囊植骨模型组破骨细胞数目(16.75±0.53)个，明显高于小鼠颅骨模型组(9.55±0.48)个(P<0.05)。

注：红色箭头标记为钛颗粒，绿色箭头标记为炎性细胞 注：红色箭头标记为钛颗粒，黄色箭头标记为骨溶解凹陷 注：红色箭头标记为钛颗粒，白色箭头标记为破骨细胞，在TRAP染色中破骨细胞被染成红褐色

图1 两种磨损颗粒诱导骨溶解模型HE染色(×20) 图2 两种磨损颗粒诱导骨溶解模型扫描电镜(×1 000) 图3 两种磨损颗粒诱导骨溶解模型TRAP染色(×20)

3 讨 论

自20世纪60年代以来，探寻一种能够完整模拟磨损颗粒诱导骨溶解的动物模型，一直是众多学者的研究方向。各国学者先后建立了多种动物模型(兔模型、羊模型、犬模型等)，但均存在不足因素。目前，在相关实验研究中运用最为普遍的动物模型主要有两种，分别是小鼠颅骨模型和小鼠植骨气囊模型，两种模型均属于磨损颗粒诱导骨溶解的病理模型。Pajarinen等人[4]指出小鼠颅骨模型在模拟骨、界膜和磨损颗粒之间假体周围微环境存在不足，也有学者[5-6]指出小鼠气囊植骨模型中植入的骨片缺少血供，植入14d后游离钙离子和退变骨胶质含量增加，可能会影响实验结果。但哪种能够准确地模拟磨损颗粒诱导骨溶解的病理学机制？依然存在争议。

随着人工关节置换术后假体周围骨溶解相关研究的不断深入和开展，假体周围骨溶解是一个长期的慢性炎症反应过程[7]。在这过程中磨损颗粒刺激炎症介质的产生起到了至关重要的作用[8-10]。同时早在20世纪90年代Granchi等人[11]研究指出在人工假体周围存在界膜组织，其主要为纤维结缔组织，能够产生释放多种炎性介质并在假体周围骨溶解中发挥促进作用。近年来多项研究同样证实了上述观点[12-15]。小鼠气囊植骨模型通过在小鼠背部建立气囊结构，能够模拟假体周围的界膜组织，弥补了其他动物模型(小鼠颅骨模型缺少假体周围组织的微环境[4])的不足之处，通过本实验研究也得以验证。在小鼠气囊植骨模型中，由于采用同基因小鼠的颅骨作为植骨材料有效地避免了组织排斥反应。术后2周取材避免了游离钙离子和退变骨胶质含量增加对实验结果的影响。取材后肉眼观察发现在钛颗粒的刺激下植入颅骨骨片与周围气囊组织之间存在明显的炎性反应，周围明显红肿、伴有新生血管的形成，这与人工关节翻修手术中见到的关节界膜组织的炎性表现相似。同时通过免疫组织化学法和扫描式电子显微镜等技术对两种动物模型进行了比较研究。比较结果显示，在炎症反应、骨溶解面积以及破骨细胞数目这三项主要指标上，小鼠气囊植骨模型组相对小鼠颅骨模型组具有明显优势。

综上所述，小鼠气囊植骨模型首先具有更好的模拟性，本动物模型不但可以模拟出磨损颗粒刺激产生的界膜组织，而且可以产生磨损颗粒诱导的骨溶解反应。此外该模型能够对骨溶解及囊壁的炎症情况等进行定性定量研究，具有科学实用性。该动物模型操作简单，费用低廉，具有广泛适用性。在模拟磨损颗粒诱导的骨溶解病理过程中小鼠气囊植骨模型模拟度更高。