聚甲基丙烯酸甲酯与磷酸钙和庆大霉素复合型骨水泥的生物力学研究

项明源，李超，王学辉，成艳琪，张涛，李朝阳*

(1.天津医科大学，天津 300192；2.天津大学，天津 300192；3.天津市第一中心医院骨科，天津 300192)

骨质疏松症是多种原因引起的一组骨病，是以单位体积内骨组织量减少为特点的代谢性骨病变，由于骨组织数量的减少和骨组织结构的变化可导致骨强度下降[1]，在受到轻微冲击时易发生骨折。其中以椎体骨质疏松性压缩骨折较为常见，在瑞典每3名70～79岁的女性中有1位被发现患有骨质疏松症，且每年要花费约为35亿瑞典克朗来治疗其导致的骨折。近几年随着中国老龄化加重，骨质疏松的发病率正逐年增加[2-3]，骨质疏松性骨折的发生率也在逐年增加，成为了骨科常见的疾病，给患者带来极大的痛苦，严重影响生活质量。所以骨质疏松性骨折越来越受到人们的重视。但是传统的手术治疗骨质疏松性骨折具有创伤大、花费高、住院时间长、疗效差等缺点，越来越难以为人们所接受。经皮椎体成形术(percutaneousvertebroplasty，PVP)是通过穿刺向患椎内注入骨水泥来治疗疾病[4]，最早产生于1987年，并于1993第一次用于治疗骨质疏松性压缩性骨折，取得了较满意的成效。经皮椎体后凸成形术(percutaneous kyphoplasty，PKP)是在PVP基础上发展起来的，可降低骨水泥的泄漏率。这两种微创手术都可增强患椎的稳定性、部分或大部分恢复患椎的高度来治疗骨折，且创伤小，恢复快，术后疼痛减轻明显，极大地提高患者的生活质量，成为目前临床上治疗老年骨质疏松性椎体压缩骨折(osteoporotic vertebral compression fractures，OVCFs)的常用方法[5-8]。

聚甲基丙烯酸甲酯(polymethyl methacrylate，PMMA)因其具有良好的力学性能，仍然是临床上常用的骨水泥[9-10]。骨水泥外溢是椎体成形术后最常见的并发症，但PMMA术后始终不能降解，渗漏到椎间盘的骨水泥可以导致椎间盘持久性高应力和细胞渗透功能减退，加速椎间盘退变，进而导致椎间盘吸收负荷分散应力的作用减弱，加之术后病椎的硬度会高于相邻椎体，导致相邻椎体的应变和应力增加，两者都可增加相邻椎体骨折的风险[11]。而且PMMA聚合时释放大量的热量，局部温度可达130℃左右[12-13]，可致其周围的组织细胞死亡，加上其还可引起过敏、局部组织抗感染能力降低、致癌等一系列不良反应，这就限制了其在临床上的应用。因此，新型骨水泥的研发成为了研究的热点，随后大量的新型骨水泥先后出现，其中磷酸三钙骨水泥β-磷酸三钙(β-Tricalcium phosphate，β-TCP)在生理条件下能自固化，如在温度(37℃)、湿度(100%)条件下发生水化反应得到与人体骨组织相近的固化产物-羟基磷灰石或透钙磷灰石，因其具有良好的可降解性[14]、骨传导性、可吸收性、生物相容性、反应不产热、无毒性、可操作性好、可用于注射[15]，成为人们研究的热点。

感染是外科常见的疾病，但是对于骨科医生感染是非常棘手的，特别是需要在关节及椎体部位植入异体骨材料及骨代替物的手术，因为感染后容易在植入物形成一层生物膜[16-17]，导致抗生素无法到达感染部位，且一般在植入物移除以前生物膜难以清除，导致治疗效果不理想，甚至导致感染暴富。在美国每年需要花费超过2亿美元来治疗此类感染[18]，所以预防此类感染的发生越来越受到人们的重视，随后人们开始研究在植入物表面及/或内部加入抗菌剂。大量带有抗生素的骨材料先后出现。庆大霉素(gentamicin，GM)属于氨基糖苷类抗生素，能与细菌核糖体30 s亚基结合，阻断细菌蛋白质合成，庆大霉素是为数不多的热稳定性的抗生素，具有广谱的抗菌谱[19]，具有良好的疗效，且其价格低廉从而广泛应用于临床。

因此本课题旨在找到一种良好的骨代替材料，具有良好的力学性能、生物相容性、可降解性、抗菌性等。我们选择了PMMA、β-TCP和GM组成复合骨水泥，希望能将其各自的良好性能组合在一起。即复合材料具有PMMA良好的力学性能可以支撑病椎，治疗并防止其进一步塌陷；具有β-TCP良好的降解性，可以在人体中无毒性降解并形成和松质骨类似的结构，具有良好的空隙结构，可以让新生骨长入其中；有GM良好的抗菌性，可以杀灭致病菌，防止生物膜形成。

1 材料

1.1 实验仪器和设备 电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；pH计(计梅特勒托利多公司)；WDW-20微控电子万能实验机(长春科新仪器有限公司)；紫外线光谱仪UV-2700(岛津企业管理(中国)有限公司)；一次性使用无菌注射器(江西丰临医用器械有限公司)；聚丙烯离心管(上海科进医疗器材有限公司)；移液器(德国艾本德股份公司)；恒温恒湿振荡器(纳诺斯克(天津)科技有限公司)。

1.2 实验试剂和材料 聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥粉末、聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥液体单体、β-磷酸钙骨水泥粉末、庆大霉素粉末。

2 方法

2.1 复合型骨水泥(PMMA/β-TCP/GM)的制备和分组 将β-TCP粉末按15%、25%、35%的总质量比分别与对应的PMMA粉末混合，将GM粉末按4%的总质量比分别加入到上述三组中，充分混合后装瓶保存，并依次编号为a、b、c组。

2.2 复合型骨水泥(PMMA/β-TCP/GM)性能的测验

2.2.1 骨水泥可注射时间检测 取一组复合骨水泥，用电子天平称取10 g，将其放入烧杯中，准备好计时器、固化液，按厂家推荐的固液比(2︰1)将5 mL固化液加入到复合骨水泥中，并开始计时，搅拌30～60 s。将搅拌好的骨水泥加入到10 mL的无菌注射器内，每隔5 s推一下注射器，直到推注射器时骨水泥不能流出为止，立即停止计时即为可注射时间，用同样的方法测定另外两组可注射时间。

2.2.2 浸泡前抗压实验检测 将a、b、c组骨水泥在常温下，按厂家推荐的固液比混合调和均匀后，加入到模具后制成圆柱体(直径6 mm，高12 mm)。将制好的不同组式样分组保存，干燥后用WDW-20微控电子万能实验机测试抗压强度(每组数据至少做6个平行实验)。

2.2.3 浸泡后体外降解率检测 将a、b、c组骨水泥在常温下，按厂家推荐的固液比混合调和均匀后，加入到模具后制成圆柱体(直径6 mm，高12 mm)。将制好的a、b、c组式样分别分成7组，每一组6个，并依此编号为a1、a2、a3、a4、a5、a6、a7组；b1、b2、b3、b4、b5、b6、b7组；c1、c2、c3、c4、c5、c6、c7组。将各组的式样干燥至恒重后称重，将各组式样按1个比5 mL的比例浸泡于盛有30 mL磷酸盐缓冲生理盐水聚丙烯的离心管中并注明对应的编号，放在摇床上摇晃，温度恒定在37℃、湿度：24%、转速：100 rpm。分别于1 d、3 d、5 d、1周、2周、3周、4周分别取出各组编号为a1、a2、a3、a4、a5、a6、a7组；b1、b2、b3、b4、b5、b6、b7组；c1、c2、c3、c4、c5、c6、c7组样本，取出后干燥至恒重后称重保存待用，浸泡液同样保存待用，用浸泡前后重量差计算降解率，降解率=(浸泡前重量-浸泡后重量)/浸泡前重量。

2.2.4 浸泡后抗压的检测 用WDW-20微控电子万能实验机测试浸泡干燥后样本抗压强度(每组数据至少做6个平行实验)，记录并比较浸泡前后抗压强度。

2.2.5 浸泡后浸泡液pH值检测 用pH计分别于1 d、3 d、5 d、1周、2周、3周、4周测量各组浸泡液的pH值，并记录数据。

2.2.6 用紫外分光仪测量浸泡液中GM量，计算样本的体外释放

2.2.6.1 紫外光谱 取一组浸泡液在200～400 nm波长范围内扫描，结果表明在281 nm时吸收峰最大。

图1 200～400 nm波长范围内庆大霉素的紫外线吸收值

2.2.6.2 标准曲线绘制 取庆大霉素适量，精确称量，加水制成每1 mL水中含庆大霉素4 mg的溶液，加水精确稀释0.1、1、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mg/mL一系列浓度的标准溶液，将该系列标准溶液，在200～400 nm内扫描，取其在281 nm处的最大值，记录并计算标准线方程。

2.2.6.3 测量并计算各组GM的浓度 用紫外分光仪测量各组的GM紫外线吸收值，取其在281 nm处的最大值，根据紫外线标准线计算其浓度，并记录。

3 结 果

3.1 骨水泥的可注射时间 a组的可注射时间为(500.33±3.14)s，b组的可注射时间为(530.17±2.31)s，c组的可注射时间为(564.83±2.14)s。a、b、c三组可注射时间的组间比较差异具有统计学意义(P<0.001)。随着β-TCP含量的增高，PMMA含量的降低，可注射时间逐渐增加。

3.2 浸泡前抗压结果 a组的浸泡前抗压强度为(66.52±2.61)MPa，b组的浸泡前抗压强度为(70.51±2.64)MPa，c组的浸泡前抗压强度为(74.92±0.92)MPa。a、b、c三组的抗压强度组间比较差异具有统计学意义(P<0.01)。

3.3 浸泡后体外降解、体外庆大霉素释放、浸泡液pH、浸泡后抗压的检测结果

3.3.1 体外降解结果 a、b、c三组复合骨水泥抗压强度的组间比较，差异具有统计学意义(P<0.001)，而且复合骨水泥的体外降解率在一定范围内随着浸泡时间的增加而增加，并随着β-TCP含量的增加而增加(见表1)。

3.3.2 浸泡后抗压结果 a、b、c三组抗压强度的组间比较差异无统计学意义(P>0.05)，且随着浸泡时间的增加骨水泥的抗压强度减小(见表2)。

3.3.3 浸泡液pH值 a、b、c三组复合骨水泥浸泡液pH值的组间比较差异有统计学意义(P<0.001)，而且复合骨水泥浸泡液的pH值在一定范围内随着浸泡时间的增加而减小，并随着β-TCP含量的增加而减小(见表3)。

3.3.4 用紫外分光仪测量浸泡液中GM量

3.3.4.1 标准曲线绘制 庆大霉素在0.1、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0mg/mL一系列浓度的标准溶液，在281 nm吸收值分别是0.067、0.133、0.170、0.206、0.242、0.277、0.312、0.347，结果表明庆大霉素在0.1～4.0 mg/mL范围内与其吸收值成良好的线性关系，符合比尔定律，其回归方程为C=13.935A-0.855 2；r=0.999 9。

3.3.4.2 浸泡液庆大霉素值的测量 取每组浸泡液在200～400 nm波长范围内扫描，取其在281 nm处的最大吸收值。再根据回归方程计算出其浓度。结果如下：a、b、c三组复合骨水泥浸泡液中庆大霉素累计释放量的组间比较有明显差异性(n=3，P<0.001)，而且复合骨水泥浸泡液中庆大霉素累计释放量在一定范围内随着浸泡时间的增加而增加，并随着β-TCP含量的增加而增加(见表4)。

4 讨 论

随着临床上椎体成形术的增加，人们对骨水泥的研究也越来越多，也越来越重视，可见一种理想的骨水泥对疾病的治疗是极其重要的。一种理想的骨水泥首先需要具备以下特性[20]：a)良好的抗压强度；b)良好的生物相容性；c)良好的骨传导性、骨诱导性、成骨性；d)良好的可塑性、可操作性；e)良好的可降解性；f)不影响修复部位微环境等。但是到目前为止还没有令人非常满意的骨水泥，且每种骨水泥都其各自的特点，本实验的目的就是将不同骨水泥的优点结合在一起，制成令人更加满意的复合骨水泥。

可注射时间是骨水泥可操作性的一种表现，一个良好的可注射时间，可以增加手术成功率。以前研究发现纯PMMA的固化时间约在111s左右，严重限制其在临床上的应用[21]，本实验研究发现随着β-TCP含量的增高，复合骨水泥的可注射时间增加，当β-TCP含量达35%时可注射时间可达564 s左右，是一个较为理想的可注射时间。

表1 三组不同时间骨水泥体外降解率比较

表2 三组不同时间骨水泥浸泡后的抗压强度比较

表3 三组不同时间骨水泥浸泡液的pH值比较

表4 骨水泥体外庆大霉素的释放量

本实验测量的抗压强度是指骨水泥开始发生形变时的所能承受的增大强度，因为在临床上如果注入的骨水泥固化后发生形变可能会影响其稳定性，可导致手术失败甚至加重病情。尚希福等发现纯PMMA的抗压强度约在95 MPa左右[22]，本实验研究示复合型骨水泥在浸泡前随着β-TCP含量的增高，其抗压的强度也随着增高，当β-TCP含量在35%时，抗压的强度可达75 MPa左右，虽然较纯的PMMA降低，但仍可以满足临床上治疗椎体压缩性骨折的需要。浸泡后骨水泥的强度逐渐降低，但是一直在临床上需要的强度范围内。

现在临床上常用的骨水泥没有可降解性，术后存在很多问题，本实验通过将β-TCP加入到PMMA中来增加其可降解性。复合骨水泥的降解速率是其可用于骨折治疗的重要指标，其降解的过快或过慢都会影响骨折愈合。本实验研究示随着β-TCP含量的增加，其降解的速率随之增加，当β-TCP含量达35%时，骨水泥的4周可降解率可达11%左右，但其是否可以为新骨形成提供良好的微环境，是否可以形成与松质骨类似的结构还需要进一步研究。

人体是在一个恒定的pH值范围内，pH值过高或者过低都可能会影响骨折的愈合。本实验显示pH值随着浸泡时间的增加，浸泡液的pH值随之降低，且β-TCP含量高的一组Ph值降低高于β-TCP含量的组，当β-TCP含量达35%时，浸泡4周后pH值达6.4左右，仍在可以接受的范围内，但是否影响骨折处新生骨的形成还需要进一步研究。

骨水泥作为抗生素的载体是治疗和预防感染的良好方法，随着医学的发展，预防疾病比治疗疾病更加重要，预防感染也是骨科非常重视的。因纯PPMA始终不能降解，所以不能满足成为抗生素载体的要求，而本实验加入β-TCP后，复合骨水泥具备成为抗生素载体的要求。本实验结果显示，随着TCP含量的增加，庆大霉素的释放量随之增加，且是缓慢长期的释放，不再像过去研究的那种骤然短期的释放，可以更加有效的治疗和预防感染。

根据以上实验数据，我们得出β-TCP在占35%质量比时，具有良好的可注射时间、抗压强度、pH值和良好的庆大霉素释放量和释放速度，最符合我们实验的目标。但是复合骨水泥浸泡后的表面及内部形貌、在动物体内的相容性、安全性、成骨性、抗压强度、降解速率、药物的释放量和速度、治疗感染的临床效果等还需要进一步研究。