hLCN6单克隆抗体偶联免疫磁珠用于混合细胞中精子的分离与法医学鉴定

陈炯，冯巍，詹飞

河南科技大学 法医学院，河南 洛阳 471023

在性犯罪案件中，从受害人处收集的检材多是来自受害者和施暴者各种细胞和体液的混合物 (混合斑)[1-3]。此类案件中，精液或精斑作为重要的法医物证检材，通常伴随受害者的生物样本成分的存在。为了确认罪犯，法医学者尝试将混合物中的男性和女性细胞分离以获取嫌疑人的DNA图谱。根据细胞的形态、大小、比重及膜成分差异等，人们建立了从含有阴道上皮细胞的混合物中分离精子的多种方法，包括差异裂解法、滤膜法、激光捕获显微切割法和流式细胞分选法等[4-7]。差异裂解法是从阴道拭子中分离精子DNA的传统方法。该方法利用精子和上皮细胞外膜特性的不同，将精子DNA与体细胞分离。此法的缺点是耗时长且自动化程度低[8]。激光捕获显微切割法实现了精子与上皮细胞的精准分离，但成本昂贵，难以普及[9-10]。此外，基于上皮细胞与精子沉降速率的差异，Horsman等研发了微流控芯片技术，实现了精子的快速分离，但该装置工艺复杂，只适用于少数细胞类型的分离[11-12]。因此，建立一种简便高效的精子分离方法仍是法医学急需解决的难题。

近年来，利用针对精子特异性蛋白的抗体结合免疫磁珠 (IMB) 技术，为精子分离提供了一种可供选择的方法。Li等[13]研究发现利用精子运动结构域蛋白3 (MOSPD3) 抗体包被的磁珠可分离混合细胞中的精子，在精子浓度 ≥105/mL时，可获得完整的男性DNA图谱。Zhao等[14]用抗精子特异性透明质酸酶 (PH-20) 抗体制备IMB，在混合物中精子/上皮细胞比例为103∶105时成功分离出精细胞。IMB法用于混合斑检验，依赖于与精子头部抗原特异性结合的抗体，因此寻找合适的抗体成为必由之路。人载脂蛋白6 (Human lipocalin 6，hLCN6) 是新发现的载脂蛋白家族成员，它由附睾分泌且能与精子结合，与精子的成熟有关[15]。用RNA 干扰的方法将大鼠体内载脂蛋白6 (rLcn6) 的表达抑制后，精子的活力降至原来的10%以下 (结果未发表)。虽然hLCN6与精子相互作用的分子机制尚不清楚，但根据其在精子上呈现的离散型斑点状分布模式，人们推断hLCN6极有可能是通过和精子表面特异性受体之间的相互作用而结合到精子上。hLCN6因其在附睾中的特异表达及所具有的生物功能在生殖医学领域受到重视，而hLCN6能够与精细胞结合的特性，使其作为特异性生物标记用于法医学精细胞鉴定以及混合斑中精细胞的分离成为可能。本实验室曾以原核表达纯化的hLCN6蛋白为抗原，成功获得了抗hLCN6单克隆抗体 (anti-hLCN6 mAb)[16]。在此基础上，本研究进一步将抗体偶联到IMB上，以期分离捕获混合细胞中的精子，尝试建立混合细胞体系内精子分离的新方法。

1 材料与方法

1.1 材料及仪器

按照知情同意的原则，实验用精液样本及女性口腔上皮细胞样本，分别由本实验室10名健康成年男性和10名女性志愿者提供。蛋白酶K和二硫苏糖醇 (DTT) 购自TaKaRa公司；QIAamp DNA微量提取试剂盒购自德国QIAGEN公司；AmpFlSTR Identifiler Plus PCR扩增试剂盒购自美国ABI公司；膜蛋白提取试剂盒购自美国Biovision公司；Sulfo-NHS-LC-Biotin、BCA蛋白定量试剂盒和增强型化学发光底物 (ECL) 购自Pierce公司；透析袋购自美国Viskase公司；Dynabeads FlowComp Flexi试剂盒与RNase-free DNase Ⅰ购自Thermo Fisher公司；鼠抗人β-肌动蛋白 (β-actin)mAb购自美国Cell Signaling公司；辣根过氧化物酶 (HRP) 标记山羊抗小鼠IgG和Dylight 488荧光标记羊抗鼠二抗购自武汉博士德公司；Prolong抗荧光衰减封片剂购自美国Life Technologies公司；其余各种化学试剂均购自Sigma-Aldrich公司。

Centrifuge 5810R型低温冷冻高速离心机和Thermomixer comfort恒温混匀仪购自Eppendorf公司；OmegaLum G型凝胶成像分析仪购自美国Aplegen公司；Sunrise型96孔酶标仪购自TECAN公司；3130XL遗传分析仪购自美国ABI公司；MagneSphere磁分离架购自美国Promega公司。

1.2 抗hLCN6 mAb亲和力的测定

利用间接ELISA法测定抗hLCN6 mAb的亲和力，以1 μg/mL重组蛋白His-hLCN6包被酶标板，封闭后加入倍比稀释的mAb，以HRP标记的山羊抗小鼠IgG为二抗，酶标仪读取OD450吸光值。当连续几个稀释度的OD450读数不再增大时视为抗原抗体100%结合，以抗体浓度 (mol/L) 为横坐标，OD450吸光值为纵坐标做散点图，生成对数趋势线和公式。将OD450最大值的一半代入公式，求出此时的抗体浓度即为mAb的亲和力解离常数 (Kd)[17-18]。

1.3 精子与口腔上皮细胞混合悬液及混合斑的制备

精液在射精后30 min内经PBS洗涤3次去除精浆及其他成分，用细胞计数板计数确定单位体积内精子数量，以PBS缓冲液倍数稀释，分别配制成精子数为103/mL、104/mL、105/mL的3组悬液。取女性志愿者口腔拭子，用PBS缓冲液洗脱后，在显微镜下计数，制成104/mL的上皮细胞悬液。同时取每位志愿者血样作为DNA分型对照样本。

取1 mL上皮细胞悬液加入到l mL已制备的不同数目的精子悬液中混匀，8 000 r/min离心5 min后弃上清，制成含约104个上皮细胞、精子数分别为103、104、105个的混合悬液 (1 mL) 3组各10份备检。同法配制上述混悬液各1 mL，8 000 r/min离心5 min后弃上清液，沉淀加50 μL PBS重悬后滴于纱布上模拟制作混合斑。

1.4 免疫印迹检测

取精子 (105/mL) 和口腔上皮细胞 (104/mL)悬液各10份，用膜蛋白提取试剂盒提取精子细胞膜蛋白，BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度，每份样品取等量 (80 μg) 进行SDS-PAGE，200 mA恒电流转膜1 h。含5%脱脂奶粉的PBST溶液 (含0.05% Tween-20的PBS缓冲液) 37 ℃封闭1 h，加hLCN6 mAb (1∶ 2 0 000稀释) 37 ℃孵育1 h，加HRP标记的羊抗鼠IgG (1∶5 000稀释) 37 ℃孵育1 h，ECL显色后进行成像分析。用β-actin作为内参。

1.5 免疫荧光检测

将冷冻保存的精子用PBS洗涤，2%多聚甲醛固定15 min后，将精子在含50 mmol/L甘氨酸的PBS中洗涤3次，沉淀重悬于PBS中，调至107/mL。取1滴细胞悬液做涂片，–20 ℃冻存。染色当天，将精子在PBS中再水化15 min，用含4%山羊血清的PBS封闭15 min。将精子与1∶500稀释的抗hLCN6 mAb孵育1 h。经PBS洗涤后加入1∶500稀释的荧光标记二抗，室温孵育60 min，洗涤后用抗荧光衰减封片剂封片，荧光显微镜下观察结果。用免疫前小鼠IgG作为对照。在光镜下(400×)，随机选取6个视野，每个视野计数50个细胞中阳性细胞数，计算平均阳性率[19]。

1.6 IMB分离混合细胞中的精子

1.6.1 hLCN6抗体的生物素标记

向hLCN6 mAb (5 mg/mL) 中加入Sulfo-NHSLC-Biotin，按试剂盒说明书的操作步骤，4 ℃反应72 h，将反应产物转移到透析袋中，加PBS缓冲液 (1 L) 4 ℃透析过夜。

1.6.2 精子细胞的捕获与分离

向制备好的精子与上皮细胞混合液 (混合斑使用前用PBS洗脱细胞) 中加入2 μL生物素标记的抗体，置于恒温混匀仪上，37 ℃、800 r/min孵育1 h，2 000 r/min离心8 min，弃上清后沉淀用500 μL PBS洗涤3遍。用100 μL PBS重悬细胞，并加入20 μL链酶亲和素包被的磁珠，5 ℃、30 r/min孵育15 min。将抗体和IMB的悬液用磁分离架吸附5 min，吸弃上清后加入200 μL预冷PBS洗涤3次，取2 μL悬液涂片镜检；用磁分离架吸附5 min，吸弃上清后加入500 μL洗脱缓冲液洗脱并回收精子，后用DNaseⅠ处理样品去除女性DNA (具体参照说明书)。

1.7 差异裂解法

按GA/T383 2002差异裂解法，提取1.3中制备的另一组混合悬液或混合斑，第一步消化后回收精子。

1.8 DNA提取、扩增及检测

将志愿者血样以及上述回收的精子按QIAamp DNA微量提取试剂盒操作步骤分别提取DNA，应用Identifiler Plus试剂盒进行PCR复合扩增，PCR产物用3130XL遗传分析仪进行电泳分离，电泳结果用GeneMapper ID v3.2软件分析。

1.9 统计学分析

以志愿者血样的DNA分型作为参考，计算IMB分离法及差异裂解法得到的单一男性分型个数，同时统计每个样本正确分型的基因座数，以正确分型13个以上、基因座峰值在200相对荧光单位 (Relative fluorescence units, RFU) 以上为检测成功。对两种方法的结果采用SPSS 20统计学软件进行χ2检验，P<0.05为具有统计学差异。

2 结果与分析

2.1 抗hLCN6 mAb亲和力的测定

利用间接ELISA 方法测定抗hLCN6 mAb的亲和力，结果表明该抗体与抗原的亲和力解离常数 (Kd) 为3.47×10–9mol/L (图1)。

2.2 hLCN6在精子及上皮细胞中的免疫印迹分析

采用Western blotting对不同个体的精子细胞进行检测，各样本均检出hLCN6蛋白，分子量约为16 kDa，与蛋白已知分子量相一致。而口腔上皮细胞中无hLCN6蛋白的表达 (图2)。

图1 抗hLCN6 mAb亲和力测定Fig.1 Affinity assay of anti-hLCN6 mAb.

图2 Western blotting检测hLCN6在精子及口腔上皮细胞的表达Fig.2 Western blotting analysis of hLCN6 expression in spermatozoa and buccal epithelial cells.1: buccal epithelial cells; 2: spermatozoa.

2.3 hLCN6的精细胞定位

用纯化的抗hLCN6 mAb对精子进行免疫荧光染色，结果显示，在精子头部的顶体后区域出现明显的荧光信号 (图3)，证明hLCN6蛋白主要分布在精子头部，这与之前文献报道一致。与hLCN6蛋白结合的精子阳性率为(90±5)% (n=6)。而对照抗体染色的精细胞头部为阴性。

2.4 Anti-hLCN6 IMBs捕获精子情况

将生物素标记的抗hLCN6 mAb包被IMBs，与细胞混合悬液进行孵育，充分洗涤后将样品制备成涂片进行显微观察。显微镜下见精子结构完整，每个精子可结合多个磁珠，主要结合在精子头部 (图4)。镜下未检测到口腔上皮细胞。

图3 抗hLCN6 mAb的免疫荧光染色分析Fig.3 Immunofluorescence analysis of anti-hLCN6 mAb staining in sperm cells.(A) Immunofluorescent staining of spermatozoa with anti-hLCN6 mAb.(B)Control immunofluorescent staining of spermatozoa with normal mouse IgG.(C, D) Sperm cells observed under a light microscope.

图4 显微镜观察anti-hLCN6 IMBs捕获精子情况Fig.4 Optical microscopy image for intact (A) and tail-lost sperm cell (B) captured by anti-hLCN6 IMBs (400×).

2.5 IMB法和差异裂解法分离精子DNA分型检测情况

图5 混合细胞悬液中精子分离的STR分型检测结果Fig.5 STR typing of spermatozoa isolated from mixed cell suspensions.Sperm cells were separated with common differential lysis (A) and anti-hLCN6 mAb IMBs-based method (B).Female epithelial cell and sperm concentrations were 104/mL and 103/mL, respectively.

为了检测anti-hLCN6 IMBs分离精子的效率和灵敏度，制备了一系列不同比例的精子-上皮细胞混合悬液和混合斑，分别用IMB法和差异裂解法对样品中的精子进行分离回收，提取精子DNA后进行PCR-STR分型检验，统计结果见表1。当混合细胞中精子数量为103/mL时，10份样品中9份得到成功分型，成功率为90%，而差异裂解法分型成功率仅为40%，两者具有显著差异 (P<0.05，图5，表1)。精子细胞数为104/mL和105/mL时，IMB法检测的单一男性13个STR基因座的正确分型率均为100%，两种检测方法成功率无明显差异 (P>0.05)。不同数量的精子 (103/mL、104/mL、105/mL)与上皮细胞混悬液制作的混合斑中，IMB法检测的各组样本13个STR基因座的单一男性正确分型率分别为40%、90%和100%，每组的10份样品中分别有0、4、10份样品获得了单一男性16个STR基因座的正确分型 (表2)。对于相同精子数量的混合悬液及混合斑，IMB法的STR检出率均高于差异裂解法 (表1、2)。

表1 不同精子数的细胞混悬液中精子DNA的STR基因座检出数Table 1 Number of STR loci successfully amplified from cell mixture suspensions with different sperm cells number

表2 不同精子数的模拟混合斑中精子DNA的STR基因座检出数Table 2 Number of STR loci successfully amplified from simulated mixed stains with different sperm cells number

3 讨论

由精液和阴道分泌液组成的混合斑是性侵案件中最常见的生物学检材，如何从男女混合成分中分离出单一男性成分并进行DNA分型，是法医物证检验中急需解决的难题[20-21]。近年来，IMB技术凭借其快速、简单、高效等特点，已被广泛应用于生物医学领域的研究，包括微生物的免疫检测、肿瘤细胞分选以及生物大分子的分离纯化等[22-23]。法医学家也尝试将该方法用于混合斑中精子的分离检测并取得了良好的结果。Arthur等[24]用MHS-10、NUH-2、HS-21三种抗体分别与磁珠偶联，实现了精子的特异性捕获，其中MHS-10磁珠的捕获率最高。Anslinger等[25]针对精子表面血管紧张素转化酶 (tACE) 抗原筛选抗体制备免疫磁珠，其中4E3抗体捕获效果最好，对含有106个精子的混合斑捕获效率接近100%。张尔力等[26]选用一种人类精子膜抗原对应的抗体——抗ADAM2制备免疫磁珠，对混合样本进行分离。结果显示在精子含量为103/mL时的分离成功率为70%。李学博等[27]利用精子特异性抗体SPAG8结合免疫磁珠技术分离混合细胞系中的精子，建立混合斑中精子细胞分离的新方法。本实验结果表明，该法用于混合细胞悬液中精子的分离效果明显好于混合斑。

已往的文献报道均是选用精子自身抗原与相应抗体结合从而进行分离，本研究是利用附睾特异性分泌蛋白hLCN6与精子结合，再用抗hLCN6单克隆抗体与之结合进而分离。前期研究中，利用抗hLCN6多克隆抗体证实该蛋白在附睾组织表达并分泌后结合到精子上，可能与精子成熟有关。本研究采用制备的抗hLCN6 mAb进行Western blotting检测发现，精子细胞中存在hLCN6蛋白，而上皮细胞中hLCN6表达呈阴性。免疫荧光实验显示，hLCN6蛋白大量分布于精子细胞表面，且以精子头部的顶体后区域浓度最高，这将有利于IMB的结合。显微镜下可见精子头部与IMBs的结合，证明了抗hLCN6 mAb结合的有效性。

本实验制备的anti-hLCN6 IMBs能够将精子从混合细胞悬液中分离出来，实验显示在精子数量为103/mL时的分型成功率达90%，明显高于差异裂解法 (40%)。这可能是由于当精子含量较少时，差异裂解法两步消化造成精子细胞损失所致。而当精子浓度≥104/mL时，所有样品均可得到单一男性分型。

IMB法对模拟混合斑中精子DNA的检验结果显示，精子数为103/mL、104/mL、105/mL的混合斑，各组样本分型成功率以及16个STR位点检出率均高于差异裂解法。在精子数相同情况下，模拟混合斑的分型成功率低于混悬液，这可能是由于混合斑中的精子在被干燥和从纱布上洗脱时，细胞发生破裂导致表面抗原数量减少[28]，影响了磁珠的结合效率所导致。鉴于一些上皮细胞可能在精子分离前被破坏，释放的女性DNA附着在IMB-精子复合物表面导致出现混合图谱(图5)，因此我们在提取精子DNA前，将IMB-精子复合物与DNaseⅠ进行孵育以消除外源DNA的污染。

综上，我们首次成功利用附睾特异性分泌的能与精子结合的蛋白进行了精子分离，建立了基于anti-hLCN6 IMBs的混合斑中精子分离的新方法。该方法简单高效，其分型成功率高于传统的差异裂解法，可解决目前精子分离中的特异性差和体细胞DNA污染等问题，不仅为性侵案件中法医学鉴别并分离精细胞及后续的个体识别提供新方法，而且为依据抗原-抗体反应分离混合斑中的精细胞开辟新途径。此项技术可作为性侵案件中法医混合斑检验的有效补充手段，对法医物证检案具有一定的实用价值。